文献解读|Cell Metab（27.7）：巨噬细胞和成纤维细胞之间的烟酰胺代谢过程调控胃癌的微环境

胃癌 (GC) 的特点是具有独特且异质性的肿瘤微环境 (TME)。虽然应用免疫检查点阻断 (ICB) 可以提高 GC 生存率，但近一半的 GC 患者对 ICB 治疗没有反应。之前的研究表明，TMEscore表征TME免疫浸润模式，比单独表达PD-L1更准确地识别将受益于ICB的GC患者（临床试验:NCT04850716）。这一观察结果表明，对ICB的反应实际上是TME复杂相互作用的结果。胃癌中显著的异质性，特别是肿瘤微环境的异质性，凸显了抗肿瘤反应是多因素相互作用的特征，然而目前还需要更深入的研究。

代谢物是参与代谢相互作用的核心中间体。然而，缺乏对代谢物与肿瘤免疫微环境 (TIME) 之间关系的系统评估。研究团队根据亚洲癌症研究组（ACRG 队列）的 GC 队列和 PRJEB2578数据集中的代谢物-蛋白质相互作用网络对整体代谢物活性进行了评分（图 S1 A），他们分析了 1800 多种代谢物和 3000 种代谢反应的预后意义，其中烟酰胺 (NAM)和 1-甲基烟酰胺 (MNAM) 在 GC 中显示出最高的免疫相关评分（图 S1 B）。具体而言，NAM 与更好的预后相关，而 MNAM 与较差的预后相关（图 1 A）。NAM 可用于皮肤癌和黑色素瘤的化学预防，19其主要代谢产物 MNAM 可削弱卵巢癌的抗肿瘤免疫反应。这种代谢反应如何介导预后意义的差异值得探索。总体而言，这些数据揭示了 NAM 代谢物在 GC 预后中相反的临床意义，这可能意味着发生了代谢相互作用。

考虑到 NAM 代谢与 TIME 之间的潜在关系，他们进一步验证了 NAM 代谢物在 ICB 反应中的临床意义。他们分析了接受免疫疗法的胃癌患者的血浆样本，使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测的NAM/MNAM比值在对免疫疗法响应(R)良好的患者（PR：部分缓解）中显著高于对免疫疗法不响应的患者(NR)（SD/PD：稳定病情/疾病进展）（图1C）。ELISA 和 LC-MS/MS 结果之间存在很强的相关性（图 S1 D），然后，他们在更大的队列中进行了 ELISA 并获得了类似的结果（图 1 B）。有趣的是，在 ICB 前后患者的配对样本中，PR 患者的 NAM/MNAM 比率高于基线水平，但 SD/PD 患者的 NAM/MNAM 比率降低（图 1 C），比率较高的患者的无进展生存期较长（图 1 D）。此外，他们在与 ICB 反应相对应的多个时间点捕获了 NAM/MNAM 比率（图 1 E-1G）。当出现治疗反应时，NAM/MNAM 比率同时增加，但随着治疗后疾病的进展而降低。

鉴于对 NAM 和 MNAM 在 GC 中的预后价值的主要观察，他们进一步在癌症中对它们进行了评估。MNAM 活性与几种实体瘤的不良预后相关（图 S1 E）。然而，NAM 活性在不同癌症类型中表现出不同的预后价值（图 S1 F）。这种变化可能与通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD + ) 代谢的复杂性和功能多样性有关。NAM/MNAM 比率在接受 ICB 治疗的非小细胞肺癌 (NSCLC) 或食管癌 (EC) 患者中表现出一致的显著性（图1H-K）。这些发现进一步支持使用 NAM 代谢物作为 GC 中 ICB 反应的指标及其在其他实体肿瘤中的类似临床价值。

代谢物是表征代谢反应活性的下游效应物，重点关注了涉及 NAM 代谢的反应。作为共有底物，NAM 可以由 NAM N-甲基转移酶 (NNMT) 催化，也可以通过 NAM 磷酸核糖基转移酶 (NAMPT)进入 NAD +挽救途径（图 2 A）。他们发现限速酶 NNMT 和 NAMPT 也表现出不同的预后意义，并与 GC 中的不同 TME 特征相关（图 2 B，S1 G-H）。NNMT 表达与肿瘤免疫功能障碍和排斥 (TIDE) 评分呈正相关，与 TMEscore 呈负相关。NNMT 表达还与高度活跃的基质和上皮-间质转化 (EMT) 途径相关（图 S1 I）。相比之下，NAMPT 表达与更高的 TMEscore 和炎症相关评分相关（图 S1 I）。总之，NAM 代谢酶 NAMPT 和 NNMT 对预后和 TIME 表型具有相反的影响。

免疫细胞是 TIME 的主要调节剂，他们对接受 ICB 的患者的 19 个 GC 组织样本进行了 单细胞转录组分析(scRNA-seq)（图 2 C）。T 细胞和上皮细胞是 GC 组织中的主要细胞类型。值得注意的是，无反应者（SD/PD）的成纤维细胞比反应者 (PR) 的成纤维细胞更丰富，而 PR 患者的巨噬细胞更丰富（图 2 D）。NAMPT 在巨噬细胞中的表达比在任何其他细胞类型中都高，而在 PD 患者中则明显较低（图 2 E）。相比之下，NNMT 表达基本上仅限于成纤维细胞，在 SD/PD 患者中表达更高（图 2 F）。GC 组织切片的相关性和共定位分析证实，NAMPT 信号与巨噬细胞标志物 CD68 信号重叠，NNMT 信号与成纤维细胞标志物 αSMA 重叠（图 2 G-H）。

总之，NAM 代谢在 GC TME 中的巨噬细胞和成纤维细胞中相对活跃。巨噬细胞和成纤维细胞中代谢酶 NAMPT 和 NNMT 的具体表达与 ICB 疗效相关。

接下来，他们研究了巨噬细胞和成纤维细胞通过 NAM 代谢所起的作用。NAD +代谢（其中 NAMPT 是限速酶）指导巨噬细胞炎症表型的维持和促炎细胞因子的产生。然而，NNMT 与卵巢癌或结直肠癌患者的预后不良有关。接下来，他们在人外周血来源的巨噬细胞中过表达 NAMPT，观察到 M1 巨噬细胞（标记 CD86）增加而 M2 巨噬细胞（标记 CD206）减少，而这种现象可以通过 NAMPT 抑制剂 FK866 逆转（图 3 A）。另一方面，在小鼠皮下肿瘤分离的 CAF (m-CAF) 中过表达 NNMT 会上调免疫抑制分子（Vimentin、Vegfa、Il10和Tgfb1）的表达（图 3 B）。

为了阐明巨噬细胞和成纤维细胞是否通过 NAM 代谢相互作用，他们建立了双向共培养系统。首先将小鼠骨髓来源的巨噬细胞 (BMDM)接种在下室中，这样可以直接接触分泌到上室中的 CAF 衍生小分子。在与 m-CAF共培养的 BMDM 中未观察到 NAMPT 表达的变化（图 3C）。随后，他们反转了接种位置，发现与巨噬细胞共培养显著抑制了 m-CAF 中的 NNMT 表达（图 3D）。他们推测巨噬细胞在代谢对抗中起主导作用，并通过 NAMPT 信号传导干扰 CAF 中的 NNMT 表达。NAMPT 以细胞内 (iNAMPT)和细胞外 (eNAMPT) 两种形式存在于哺乳动物中，其中 eNAMPT 表现出更广泛的功能。研究报告称 EV 是 eNAMPT 的主要载体之一。为了验证 EV 是否是参与相互作用的介质，他们首先将巨噬细胞培养上清液分离成囊泡(EV/EV +)和非囊泡(EV −)成分，观察到 EV/EV +成分（而非 EV −成分）下调了 NNMT 表达。免疫荧光 (IF) 染色显示 NAMPT 与巨噬细胞中的 EV 标志物 CD63 共定位（图 3 E）。纳米粒子跟踪分析 (NTA) 显示 EV和 EV2（分离的EV） 的直径范围为 100 至 120 nm（图 3 F），与传统外泌体的直径相似。将 CAF与 BMDM 共培养或用 BMDM 衍生的 EV 处理。随着 EV 浓度的增加，CAF中的 NNMT 表达逐渐降低。EV 处理也抑制了 MFC 中 EMT 标志物的表达。更重要的是，BMDM 衍生的 EV 增加了 NAMPT 水平并降低了 CAF中的 NNMT 表达（图 3 G）。这些数据共同表明，巨噬细胞分泌的含 NAMPT 的 EV 是抑制 CAF 中 NNMT 表达的 NAM 代谢相互作用的核心介质。

为了验证含 NAMPT 的 EV在体内的抗肿瘤作用，他们使用小鼠 GC 细胞系 YTN-16 产生皮下肿瘤（图 3 H）。氯膦酸盐脂质体 (Clo) 用于特异性地去除和消除内源性巨噬细胞的作用。经过 5 个周期的治疗后，观察到肿瘤中巨噬细胞浸润减少了 4 倍。自体注射 BMDM 或 BMDM 衍生的 EV 后肿瘤生长受到显著抑制（图 3 I-J）值得注意的是，用 NAMPT 过表达的 BMDM 或 EV 治疗导致小鼠血浆 NAM/MNAM 比率显著增加（图 3 K），这一发现与在 GC 患者中的发现具有相同的意义。

由于 CD8 + T 细胞是负责肿瘤杀伤作用的主要细胞，他们评估了小鼠原位的 CD8 + T 细胞群。用 NAMPT 过表达的 BMDM 或 EV 治疗会增加 T 细胞中细胞毒性分子颗粒酶 B (GZMB) 和 IFN-γ 的水平（图 3 L）。总体而言，巨噬细胞及其分泌的含有 NAMPT 的 EV 可以破坏 CAF 中的 NAM 代谢，并在体内GC 中产生有利的 CD8 + T 细胞介导的 TIME 。

他们进一步分析了巨噬细胞和成纤维细胞是否通过 NAM 代谢串扰调节 CD8 + T 细胞功能。首先，对 40 个 GC 患者的组织切片进行了 IF。CD8 密度与 NAMPT 和 CD68 的表达呈正相关，但与 NNMT 和 αSMA 的表达呈负相关（图 4 A-B）。他们用不同比例（巨噬细胞：CAF = 1:3 或 3:1）的人 GC 组织分离的 CAF 和外周血来源的巨噬细胞的混合物刺激人外周血来源的 CD8 + T 细胞。当巨噬细胞比例更高或 NAMPT 水平更高时，T 细胞会转向活性表型（图 4C），从而减弱 CAF 的抑制作用。此外，T 细胞上清液的 NAM/MNAM 比率也升高了（图 4D）。如上所述，巨噬细胞通过 EV 主导与 CAF的代谢相互作用。接下来，他们用梯度浓度的巨噬细胞衍生的 EV 处理 CAF，然后将它们与 CD8 + T 细胞共培养。CAF显著降低了 CD8 + T细胞的细胞毒性，但增加 EV 浓度会恢复 CD8 + T 细胞活性（图 4E）。这些结果表明巨噬细胞衍生的 EV 可以逆转CAF 诱导的CD8 + T 细胞功能障碍。此外，外源性 MNAM 处理或 CAF 共培养减弱了 CD8 + T 细胞的细胞毒性（降低 IFN-γ 和肿瘤坏死因子 α [TNF-α]），这种影响很大程度上依赖于 NNMT 表达或活性（图 4 F-G），这表明表达 NNMT 的 CAF 通过代谢物 MNAM 抑制 T 细胞功能。

鉴于在患者、小鼠和细胞共培养系统中发现的 NAM/MNAM 比率的重要性，他们进一步研究了 NAM/MNAM 比率是否足以影响 T 细胞功能。NAM 和 MNAM 的添加也以剂量依赖性方式改变了 T 细胞功能（图 4 H），这表明巨噬细胞和 CAF 通过 NAM 代谢相互作用动态调节 CD8 + T 细胞功能。

接下来，他们探究了巨噬细胞衍生的 EV 抑制 NNMT 表达的机制。11 条致癌通路的差异分析表明，在 GC 中，NNMT 高表达组中 NOTCH、WNT 和 HIPPO 通路显著上调（图 5 A），其中 NOTCH 通路激活的基因与 NNMT 表达的相关性比 WNT 和 HIPPO 通路中的基因更强（图 5 B）。此外，WNT 激动剂和 HIPPO 抑制剂均不影响 NNMT 表达。因此，他们认为 NOTCH 通路可能与 NNMT 表达有关。CAF 中 NOTCH 信号失调会促进癌细胞增殖、EMT 和血管生成。他们观察到过表达 NOTCH 通路转录因子 RBP-J 会上调 NNMT 以及 NOTCH 通路靶基因（HES1 和 HEY1）的表达，而用RBP-J 抑制剂 RIN1 治疗会逆转 NNMT mRNA和蛋白质水平的变化（图 5C）。他们在JASPAR数据库中进行了预测分析，并在NNMT基因启动子区（转录起始位点[TSS]上游2000 bp）中确定了5个候选RBP-J结合位点，然后使用染色质免疫沉淀法验证这些候选位点（图5 D）。两个位点（site3，-1471∼-1462 bp；site5，-300∼-291 bp）在anti-RBP-J pull-down分析中富集，表明RBP-J 可以直接与NNMT启动子区结合（图5 E）。随后的荧光素酶报告基因检测证实两个位点均能够激活NNMT 转录（图5 F）。这些结果表明NNMT可能是NOTCH 通路的直接靶基因。

NAMPT 上调 NAD 消耗酶 SIRT 家族，从而维持 NAM 稳态。他们发现含有 NAMPT 的 EV 抑制了 NOTCH 信号传导（RBP-J、HEY1 和 HES1）和 NNMT 表达。用 SIRT1 抑制剂 Selisistat 治疗可逆转 NNMT 水平的下降，这表明 EV 可能通过 SIRT1 发挥作用（图 5G）。SIRT1 是一种脱乙酰酶，据报道可拮抗乙酰化诱导的 NICD 稳定。他们随后探究了 SIRT1 是否通过翻译后修饰影响 NNMT 表达，发现 EV 降低了 NICD 的乙酰化，而 Selisistat 挽救了 NICD 乙酰化（图 5 H）。从机制上讲，EV 增加了 NICD 的泛素化，从而增加了其蛋白酶体降解，从而影响了 NICD 蛋白的稳定性（图 5 I）。他们将突变质粒转染到 CAF 中可消除 NICD 的乙酰化，并且 NNMT 表达对 EV 处理具有抗性（图 5 J）。EV 对 CAF 代谢的破坏最终影响了 CD8 + T 细胞的细胞毒性（图 5 K）。这些结果表明，含有 NAMPT 的 EV 通过激活 SIRT1 介导 NAM 代谢相互作用，从而损害 NICD 核表达和 NNMT 转录激活。

他们进行了体内实验，以评估含 NAMPT 的 EV与抗 PD-1 + 联合化疗(CT)的疗效（图 6 A）。抗 PD-1 单药治疗对皮下肿瘤的作用有限，自体注射 BMDM 衍生的 EV后，肿瘤生长受到抑制（图 6 B-C）。流式细胞分析和免疫组织化学显示，NAMPT 过表达 EV组的 T 细胞浸润和活性最高，这表明含 NAMPT 的 EV 可以作为消除肿瘤的有力工具（图 6 D-F）。此外，IF 染色显示，EV 治疗后肿瘤中的 NNMT 水平降低（图 6 G）。NAM/MNAM 比率显著增加，对抗 PD-1 联合疗法的反应更好（图 6 H）。总之，通过施用含 NAMPT 的 EV（代谢相互作用的关键介质）来靶向调控NAM 代谢，可以恢复 GC 对抗 PD-1 治疗的敏感性，并正在成为一种有前途的治疗策略。

本项研究通过转录组分析和动态血浆样本分析，发现了肿瘤微环境中的代谢“对峙”机制，如烟酰胺代谢的双重预后意义所示。具体而言，分别表达限速酶烟酰胺磷酸核糖基转移酶和烟酰胺 N-甲基转移酶的巨噬细胞和成纤维细胞调节烟酰胺/1-甲基烟酰胺比率和 CD8+ T 细胞功能。从机制上讲，烟酰胺 N-甲基转移酶由 NOTCH 通路转录因子 RBP-J 转录激活，并进一步由巨噬细胞衍生的含有烟酰胺磷酸核糖基转移酶的EV抑制。通过自体注射细胞外囊泡来调控烟酰胺代谢可恢复胃癌中的 CD8 + T 细胞细胞毒性和抗 PD-1 反应。