文献解读|Nat Immunol（27.7）：代谢调节因子 PKM2 的缺乏会激活戊糖磷酸途径并产生 TCF1 +祖细胞 CD8 + T 细胞以改善免疫疗法

CD8+ T 细胞是抗肿瘤免疫反应的关键决定因素。它们的治疗效用已通过患者细胞群和药理学试剂（包括免疫检查点阻断）的过继细胞转移 (ACT) 方法得到充分利用。ACT方法，包括嵌合抗原受体T (CAR -T)细胞疗法，需要体内转移患者自身的淋巴细胞，这些淋巴细胞可以进行扩增、选择和基因改造，以增强其抗肿瘤特异性和功效。TCF1high祖细胞 CD8 + T 细胞介导免疫疗法的疗效；然而，控制其产生和维持的机制尚不清楚。

为了研究转录组进化与肿瘤进展的关系，研究团队对非小细胞肺癌 (NSCLC) HKP1 原位小鼠模型中的肿瘤浸润性 CD8 + T 细胞（图1a）进行了转录组分析(RNA-seq)。主成分分析 (PCA) 显示样本聚类与时间和肿瘤负荷有关（图1b）。他们整合了公开发表的抗 PD-1 治疗数据集，评估大肿瘤（无反应）和小肿瘤（有反应），以确定干预的分子靶点。通过基因集富集分析(GSEA)鉴定了 343 个差异表达基因(DEG)，结果显示，在未治疗和抗 PD-1 治疗的数据集中，与小肿瘤或早期肿瘤相比，大肿瘤的 CD8+ T 细胞中多种代谢通路发生显著富集，其中糖酵解/糖异生是富集程度比较高的通路（图1c-d）。DEG分析显示，来自较大肿瘤的 CD8+ T 细胞中糖酵解基因表达增加，表明代谢活跃但无效的抗肿瘤反应（图1e）。代谢与 T 细胞表型和功能相关，因此他们通过使用表达 Ova 257-264 的肿瘤细胞共培养系统进行shRNA 筛选，来探究单个糖酵解基因对 T 细胞分化的影响，Ova 257-264是肺癌模型中常用的一种明确抗原，OT-I 细胞发生激活（图1f），随后与 HKP1-ova-GFP 细胞共培养。共培养的 T 细胞最初表达效应细胞因子和颗粒酶 B (GzmB)，具有适度的 Tox 和检查点蛋白表达以及表达 TCF1 的亚群。随着时间的推移，T 细胞获得效应蛋白和 TCF1 表达降低，Tox 和检查点蛋白表达升高。利用这种共培养系统，他们进行了针对差异表达糖酵解基因的 shRNA 筛选（图1c）。与已知的糖酵解最佳效应活性一致，大多数酶的敲低导致效应器功能减退状态（图1g）。丙酮酸激酶M基因 (PKM) 的敲低导致 TCF1 和 SlamF6 的上调，这是祖细胞样状态的标志（图 1g）。总之，这些结果表明干扰丙酮酸激酶后分化发生了独特的改变。

PKM 有两种亚型，PKM1 和 PKM2，它们的不同之处在于第九个外显子。HKP1模型中的CD8 + TIL中的亚型分析（图1a）显示更高的 PKM2 转录本丰度。共培养的 T 细胞也显示 PKM2 表达增加且持续，而 PKM1 表达保持不变（图2a）。HKP1-ova-GFP 肿瘤模型中的幼稚或体外活化的 T 细胞的 ACT 导致 PKM2 表达高于基线水平（图2b-c），这些数据表明 PKM2 在激活时上调。

接下来，他们使用共培养系统来确定 PKM 缺乏对 T 细胞表型的影响，用 shRNA 感染活化的 T 细胞，并将它们与 HKP1-ova-GFP 细胞共培养。在初次刺激后第 6 天，shPKM T 细胞显示 SlamF6 和 TCF1 表达增加，GzmB、TIM3 和 CD39 表达降低（图2d），他们观察到 PKM 敲低后产生细胞因子的群体减少，而 TCF1high群体的丰度增加（图2e-g）。共培养的PKM2 敲除 (PKM2KO) T 细胞显示 SlamF6 和 TCF1 升高，GzmB、IFNγ 和 TNFα 降低（图2h-k）。PKM2 敲除导致 TCF1high细胞群丰度增加，而产生细胞因子的细胞群减少（图2i-k）。PKM2 缺失导致细胞活力损失极小，但增殖减少。PKM2 KO导致 CD44+ CD62L +细胞比例增加，CD44+ CD62L−细胞活力相似但略低，并且两个亚群的增殖均显著减少。PKM2 缺失对改变分化具有持久的影响，在初始刺激后第 9 天，TCF1high细胞比例持续升高，而 PKM2 野生型(PKM2WT)T 细胞具有更深的耗竭表型。他们还用不同的抗原-TCR 检测了 PKM2 缺失的影响。pmel-1 T 细胞中 PKM2 的缺失同样导致 TCF1 +、CD62L +和 SlamF6 +群体比例增加。总之，这些数据表明 T 细胞活化后 PKM2 的缺失会降低效应细胞分化。

接下来，他们评估了 PKM2KO在体内的效果。为了确保 ACT 后细胞的稳健植入，他们使用低剂量辐射（5 Gy）对淋巴细胞清除的 HKP1-ova-GFP 荷瘤小鼠进行照射。为了控制小鼠间的异质性，他们将混合的 PKM2 KO和PKM2 WT OT-I + T 细胞（以 Thy1.1 接合性为特征）过继共转移(co-ACT)到淋巴细胞清除的 HKP1-ova-GFP 小鼠中（图3a-b），并在多个时间点检测肿瘤和引流淋巴结 (dLN) 中的 T 细胞。PKM2 WT细胞迅速成为肿瘤中的主要转移群体，但仅在实验后期才显著超过 dLN 中的PKM2 KO细胞（图3c-e）。与 PKM2 WT相比，PKM2 KO细胞在重新刺激后均显示肿瘤和 dLN 中的 IFNγ 和 TNFα 表达降低（图3f-g），并且在肿瘤和 dLN 中均富集 CD44 + CD62L +细胞（图3h-i）。此外，肿瘤和 dLN 中的 PKM2 KO细胞显示 TCF1 和 Eomes 增加，而 Tbet 表达减少（图3j-m）。总之，这些表明存在伴有 PKM2 丢失的祖细胞耗竭样表型。

为了确定 PKM2 在 T 细胞中缺失的影响在不同肿瘤类型中有何不同，他们采用了 B16F10-ova-GFP 黑色素瘤模型。幼稚和体外活化的 T 细胞的 ACT 都导致 PKM2 表达增加，但随着时间的推移而消退（图4a-b）。淋巴细胞耗竭的 B16F10-ova-GFP 小鼠的 Co-ACT（图4c-d）显示，肿瘤和 dLN 中 PKM2WT T 细胞占主导地位，细胞因子表达更高（图4e-i），而 PKM2KO T 细胞表现出祖细胞耗竭样表型的富集，两个组织中两个时间点的CD44+ CD62L +比例均升高，在较晚的时间点上TCF1和Eomes表达增强（图4j-o）。总之，数据表明，PKM2 在多种肿瘤类型中具有调节 T 细胞分化的一致作用，但其作用程度在不同癌症中存在差异。

CD8+ T 细胞中 PKM2 的缺失导致了 TCF1high祖细胞耗竭样表型，但不足以影响肿瘤生长或小鼠整体存活率（图5a-c）。TCF1+ CD8 + T 细胞可介导 PD-1 检查点阻断的功效。为了确定 PKM2 缺乏导致的 TCF1highCD8 + T 细胞比例增加是否影响 PD-1 抑制的抗肿瘤活性，他们在 HKP1-ova-GFP 小鼠中检测了 PKM2 WT 和 PKM2 KO OT-I + T 细胞的 ACT 和抗 PD-1 处理的组合。PKM2 KO CD8 + T细胞与抗PD-1联合使用可显著抑制肿瘤生长并提高存活率（图5d-f）。在开始抗 PD-1 治疗后 4-5 天观察到 ACT 和抗 PD-1 联合处理显著控制肿瘤。PKM2 WT和 PKM2 KO T 细胞在 dLN 和肿瘤中表现出相似的丰度，其中 TCF1high细胞在 dLN 中占主导地位，而抗 PD-1处理后 TCF1low细胞富集，但肿瘤间差异很大。

为了进一步研究 PD-1 抑制的效果，他们进行了混合基因型co-ACT，然后进行抗 PD-1 或 IgG，随后进行流式细胞分析。与 PKM2WT T 细胞相比，在 PKM2KO T 细胞中，他们观察到(1)细胞比例降低；(2)祖细胞样（CD44 + CD62L +、CD127 + Klrg1 −）群增加和效应细胞样（CD44 + CD62L −、CD127 − Klrg1 +）群减少；(3) TCF1high细胞比例增加；(4) IFNγ+ TNFα+比例降低。无论基因型如何，TCF1high细胞均显示出与 TCF1low细胞相比增加的 Ki67 表达，表明增殖更多。抗 PD-1 处理导致基因型之间相似的表型：随着时间的推移，肿瘤中 CD44+ CD62L −细胞的比例增加，加速向肿瘤中 TCF1low表型的进展，并且在最新时间点肿瘤中 TCF1high细胞中 Ki67 表达更多的趋势。值得注意的是，即使使用抗 PD-1处理，对检查点阻断反应至关重要的祖细胞样群体在PKM2KO下也能更好地维持。

为了进一步探索 PD-1 抑制如何对 PKM2 KO CD8+ T 细胞产生不同的影响，他们在 HKP1-ova-GFP 模型中对来自混合基因型co-ACT 与 IgG 或抗 PD-1 结合的分选供体 TIL 进行了 RNA-seq（图5g）。对样品根据基因型、治疗状态和时间进行聚类（图5h）。PKM2KO细胞显示出记忆和祖细胞耗竭特征的富集，而 PKM2WT细胞中效应子和终末耗竭特征则相应富集（图5i-k）。Hallmark数据集显示 PKM2 WT细胞表现出更具增殖性的表型，这与其丰度成比例增加相一致，并且补体特征增强（图5l）。基因型特征差异随时间推移而变化：PKM2WT细胞早期显示出与细胞增殖和糖酵解相关的特征的富集，后期显示出与炎症相关的特征。与 IgG 相比，抗 PD-1处理富集了更具增殖性和代谢活跃的状态（图5m）；这些趋势也随时间推移而变化，早期增殖相关特征存在差异，后期炎症相关特征存在差异。最后，他们研究了 PKM2 WT和 PKM2 KO细胞对抗 PD-1 治疗的不同反应。抗 PD-1 反应的子集在基因型之间是保守的，包括激活标志性特征 E2F 靶点、G2M 检查点和糖酵解等（补充表7）。不同的是，在 PKM2 WT细胞中，抗PD-1 治疗诱导与增殖相关的标志性通路富集，包括顶端连接和有丝分裂纺锤体，而在 PKM2 KO细胞中，治疗诱导氧化磷酸化 (OXPHOS) 富集，表明代谢发生了变化（图5n）。GO分析证实了这一点，在PKM2 KO细胞中ATP合成偶联电子传递、线粒体呼吸链复合物组装、OXPHOS、电子传递链等通路显著富集。OXPHOS和脂肪酸氧化都与记忆细胞能量利用有关，验证PKM2 KO细胞的祖细胞表型，并表明对抗PD-1疗法的代谢反应。总之，这些数据证实了PKM2缺失引起的分化状态改变，并证明了其对检查点阻断反应的影响。

PKM2 是一种限速糖酵解酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP) 转化为丙酮酸。此外，PKM2 可以作为转录调节因子，改变 HIF1α、mTOR、STAT1、STAT3、STAT5 和 TGFβ/Smad2/3 信号传导的活性。他们检测了活化的 CD8 + T 细胞中 PKM2 的亚细胞定位，观察到细胞质表达，而几乎没有核 PKM2 表达，这表明 PKM2 主要在 CD8 + T 细胞中起代谢作用。然后，他们从共培养物中分选出 PKM2 WT或 PKM2 KO OT-I + T 细胞并评估糖酵解活性。与 PKM2 WT细胞相比，PKM2 KO T 细胞的糖酵解和糖酵解能力降低（图6a-b）；然而，不同基因型之间的脂肪酸和谷氨酰胺氧化相似。随后，他们在多个时间点进行了稳态极性代谢物分析，以评估 PKM2 缺失引起的代谢改变。与 PKM2WT相比，从共培养中分选出的 PKM2 KO T 细胞显示糖酵解中间体的积累。PEP（可以干扰其他糖酵解反应）和 3-磷酸甘油酸都在共培养的 PKM2 KO T 细胞中在早期时间点表现出大量积累。PKM2 KO T 细胞进一步显示出磷酸戊糖途径(PPP)代谢物的富集。糖酵解和 PPP利用葡萄糖作为燃料来源，他们也共同产生几种代谢中间体，包括葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸和甘油醛-3-磷酸。PPP 在活化的 T 细胞中生成 NADPH 和核糖-5-磷酸。值得注意的是，果糖-6-磷酸既是糖酵解中间体，也是 PPP 非氧化阶段转酮醇酶和转醛醇酶活性的重要产物，并在后期时间点富集。这些数据表明，PKM2 缺失会导致糖酵解减少和 PPP 代谢物丰度增加。

接下来，他们使用 1,2- 13C 标记的葡萄糖进行了代谢分析。使用在位置 1 和 2标记的葡萄糖可以区分由糖酵解或 PPP 活性产生的代谢物，并通过不断发展的代谢物标记模式观察多轮 PPP 活性，甚至产生大于 m+2 的电荷。他们在初次刺激后第 4 天和第 6 天从共培养中分选出转基因 T 细胞，将它们与 1,2- 13 C 标记的葡萄糖一起孵育 2 小时并进行极性代谢物分析。MetaboAnalyst分析表明PKM2 丢失对两个时间点的 PPP 都有显著影响（图6c）。在初始刺激后第 6 天，他们在 PKM2 KO T 细胞中观察到标记的 3-磷酸甘油酸和 PEP 的积累，表明糖酵解流受损，以及标记的葡萄糖酸、核糖-5-磷酸和景天庚酮糖 7-磷酸的比例增加（图6d-k）。葡萄糖酸是进入氧化 PPP 的切入点，而核糖-5-磷酸和景天庚酮糖 7-磷酸是在非氧化 PPP 中产生的两种关键产物。他们进一步观察到与单轮糖酵解或 PPP 产生的代谢物相比，同位素电荷不同的代谢物比例增加，表明 PKM2KO T 细胞中存在多个 PPP 循环（图6f-g）。在初始模拟后的第 4 天，他们观察到 PKM2 KO 对三羧酸 (TCA) 循环产生了更显著的影响，标记的 3-磷酸甘油醛、3-磷酸甘油酸、PEP、5-磷酸核糖和氧戊二酸显著增加，而 7-磷酸景天庚酮糖减少。标记模式再次显示同位素电荷，表明发生了多轮 PPP 活性。总之，这些数据表明 PKM2 缺失会导致糖酵解通量改变和 PPP 代谢物生成增加。

为了检测 PPP 活性升高对 T 细胞分化的影响，他们使用了 AG1，它是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 (G6PD)的特异性小分子激动剂，G6PD是催化 PPP 氧化期第一步和关键步骤的酶。AG1可稳定活性 G6PD 二聚体，将单体/单体界面桥接在靠近 NADP+结合位点的位置，并且在体外或体内对 G6PD 缺乏系统几乎没有影响。用 AG1 共培养处理导致 CD8 + T 细胞活力和增殖略有降低。他们进一步观察到，AG1 处理后CD44 + CD62L +细胞比例增加，AG1 处理组中 CD44 + CD62L +和 CD44 + CD62L −细胞活力相似。他们观察到 AG1 处理后 TCF1 +细胞比例增加、Eomes 表达增加、IFNγ 产生减少（图7a-d），这与 PKM2 KO表型一致。随后他们探究 PPP 激动是否通过抑制糖酵解来诱导这种表型，从而导致效应子分化受到抑制。他们从共培养中分离出 OT-I+ T 细胞，并用载体 DMSO、AG1 或己糖激酶抑制剂 2-脱氧葡萄糖 (2-DG) 处理它们 2 小时。虽然用 2-DG 进行急性处理导致糖酵解几乎完全停止，但 AG1 处理对糖酵解几乎没有影响，这表明 PPP 激动剂改变了分化，而与糖酵解损失无关（图7e）。

为了评估这些代谢过程对 CD8+ T 细胞分化的影响，他们激活细胞 1 天，然后开始用 DMSO、AG1 或 2-DG 处理。将细胞再扩增一天，然后将它们与 HKP1-ova-GFP 细胞共培养并继续处理，在初次刺激后第 6 天分选 eGFP +和 eGFP −细胞并进行RNA-seq。与 DMSO 相比，AG1 和 2-DG 处理均导致 eGFP +比例增加（图7f-g）。2-DG 处理导致 eGFP −细胞几乎完全丢失（图7f）。基于 TCF1 状态的样本之间以及基于处理的eGFP +或 eGFP −细胞之间存在较大的基因表达差异，其中 2-DG-eGFP +细胞是转录最不同的组（图7h-i）。比较 eGFP +和 eGFP −细胞发现预期的基因表达差异，包括eGFP +细胞中Sell、Fos、Id3和Tcf7增加，以及eGFP −细胞中Gzmb、Id2、Cd244a和Havcr2增加，从而确定了跨多种代谢方式保守的关键机制（图7j）。

随后，他们研究了在不同代谢刺激下 eGFP +细胞之间的基因表达如何变化。与 DMSO 相比，AG1 和 2-DG 均诱导了强烈的转录改变，而 2-DG 诱导了更广泛的差异表达（图7k）。2-DG–eGFP +和 DMSO–eGFP +样品之间的基因表达差异很大，而 AG1–eGFP +和 DMSO–eGFP +细胞之间的差异较小，在 2-DG–eGFP +与 DMSO–eGFP +比较中，药物治疗改变的基因有 9.1% 的上调基因和 25.5% 的下调基因重叠，但在 AG1–eGFP +与 DMSO–eGFP +比较中，有 53.5% 的上调基因和 73.1% 的下调基因重叠（图7k）。直接比较 AG1–eGFP +和 2-DG–eGFP +样本，证明了由 PPP 激动或葡萄糖阻断产生的TCF1+细胞中的转录异质性，与2-DG–eGFP + 样本相比，AG1–eGFP +样本中有 431 个基因表达显著增强，467 个基因表达显著降低（图7k-l）。标志分析显示，与 2-DG–eGFP +样本中的未折叠蛋白反应和缺氧相关通路相比，AG1–eGFP +样本中的增殖和炎症通路富集（图7m）。总之，这些数据表明 PPP 激动和葡萄糖阻断都会诱导 TCF1 +群体，但转录格局存在很大差异。

最后，他们探索了导致 PKM2 KO和 PKM2 WT和 AG1 和 DMSO之间基因表达差异的保守因子的上游调节因子。分析显示，在不同实验条件之间重叠的上游调节因子数量有限，包括 Bach2 和 Foxo1（图7n）。据报道，Bach2 和 Foxo1 是 TCF1 表达的上游诱导剂和记忆形成与维持的调节因子，并且在两个 RNA-seq数据集中表达均增加。他们在初始刺激后 4 天在共培养中检测了它们的表达，发现PKM2 KO和 AG1 处理均使 Foxo1 和 Bach2 的表达增加（图7o）。总之，这些数据表明 PKM2 KO和 PPP 激动之间转录因子机制的共同表达会诱导 TCF1 表达。

与 PKM2KO类似，PPP 激动剂在体外导致 TCF1群体增多，因此他们检测了与抗 PD-1 联合使用是否会同样增强体内抗肿瘤功效。预处理的 OT-I + T 细胞过继转移到 HKP1-ova-GFP 小鼠中，随后小鼠接受抗 PD-1处理（图8a）。用 AG1 预处理导致 ACT 前 CD44+ CD62L+和 TCF1 +细胞比例增加（图8b-c）。AG1 预处理与抗 PD-1 联合使用可更好地控制肿瘤并提高总体生存率（图8d-f）。总之，这些结果表明 PPP 激动剂表型复制了 PKM2KO与抗 PD-1 联合使用增强的体内抗肿瘤功效。

小鼠研究表明 PPP 激动剂能够有效诱导 TCF1+祖细胞状态并与检查点阻断产生协同作用。因此，他们在人类免疫功能正常的患者来源的肿瘤类器官 (PDTO) 系统中检测了 AG1 的作用（图8g）。他们从 NSCLC 患者的标本中生成 PDTO，并在有或没有 AG1 的情况下从自体外周血单核细胞 (PBMC) 中快速扩增T 细胞（图8g）。用 AG1 处理导致 CD8+ T 细胞活力略有降低和增殖减少。检查不同的细胞亚群，观察到用 AG1 处理后CD45RA+细胞增加而 CD45RO+细胞减少。他们还观察到用 AG1 处理后所有亚群的活力降低，增殖减少，这在 CD45RO+细胞中最为明显。值得注意的是，AG1 治疗显著增加了 TCF1 表达（图8h）。AG1 处理的 T 细胞产生了更高水平的 IFNγ（图8i）。值得注意的是，在四名患者中样本中，AG1 处理的 T 细胞诱导了更高比例的凋亡类器官（图8j）。总之，这些数据表明 PPP 激动剂可能会增强人类 T 细胞的抗肿瘤能力。

本项研究表明通过敲除PKM2靶向糖酵解会导致PPP活性升高，从而导致 TCF1high祖细胞耗竭样表型的富集和对体内 PD-1 阻断的响应性增强。PKM2 KO CD8 + T 细胞显示糖酵解通量减少、糖酵解中间体和 PPP 代谢物积累以及 PPP 循环增加，如通过 1,2- 13 C 葡萄糖碳示踪所确定的。在没有急性糖酵解障碍的情况下，PPP 的小分子激动剂激动剂处理的 CD8 + T 细胞的过继转移与 PD-1 阻断相结合增强了小鼠的肿瘤抑制，并促进了患者衍生的肿瘤类器官中的肿瘤杀灭。