Signal Transduction and Targeted Therapy（81.2）：肿瘤引流淋巴结通过富集肿瘤反应性效应耗竭 CD8+ T 细胞重塑肿瘤微环境

肿瘤引流淋巴结（TdLNs）是抗原递呈和 T 细胞启动的重要场所，也是影响 ICB 疗效的关键免疫器官。已有研究提示，Tpex 可在 TdLNs 中被激活、扩增，并进一步迁移至 TME 参与抗肿瘤免疫。CRC 可分为 MSI 和 MSS，两者在免疫浸润、预后和 ICB 敏感性方面差异显著，但目前多数研究集中在肿瘤组织本身，TdLNs 如何参与塑造 MSI/MSS CRC 的免疫差异仍不清楚。另一方面，耗竭 CD8+ T 细胞并不等同于完全失功能。近期研究显示，部分具有终末耗竭表型的 CD8+ T 细胞仍可保留较强效应功能。本文围绕这一问题，系统比较 MSI 与 MSS CRC 的 TdLNs 和 TME，重点解析肿瘤反应性 CD8_Texeff 细胞的来源、功能、空间定位及其与免疫治疗反应之间的关系。

研究团队首先从整体层面描绘 MSI 和 MSS CRC 的免疫生态。研究设计覆盖 CRT、CRN、PBMC 和非转移性 TdLNs，并结合 scRNA-seq 与 scTCR/BCR-seq 同时获取细胞组成和克隆信息，为后续追踪 T 细胞来源奠定基础（图1a）。经过质控后，研究团队共获得 195,298 个单细胞转录组数据，并根据 UMAP 聚类和代表性标志基因，将其划分为常规 alpha beta T 细胞、gamma delta T/NK 细胞、B/浆细胞、髓系细胞、肥大细胞、上皮细胞和成纤维细胞等主要群体（图1b-c）。不同组织的免疫构成呈现明显差异：TdLNs 主要由 alpha beta T 细胞和 B/浆细胞组成，PBMC 中 T/NK 细胞占比较高，而 CRT 中 CD8+ T 细胞浸润最突出（图1d）。这说明同一患者体内的外周血、引流淋巴结、正常组织和肿瘤组织并不是简单共享同一种免疫状态，而是形成了彼此关联但功能不同的免疫区室。进一步聚焦 CD8+ T 细胞后，研究团队识别出 7 个亚群，其中 CD8T_CCR7 和 CD8T_GZMK 更偏向 TdLNs，CD8T_CXCL13 和 CD8T_HSPA1A 则在肿瘤组织中富集（图1e-f）。从功能状态看，肿瘤浸润 CD8+ T 细胞同时表达效应分子和耗竭相关基因，提示 TME 中存在一类兼具效应与耗竭特征的 CD8+ T 细胞群体，也为后续锁定 CD8_Texeff 提供了入口（图1g）。

为了进一步拆解 CD8+ T 细胞的耗竭谱系，研究团队没有简单按照单个标志物分群，而是综合初始状态（naive）、记忆状态（memory）、效应状态（effector）和耗竭状态（exhaustion）四类评分，先区分具有干细胞样特征的早期状态，再将更分化的细胞按效应和耗竭程度细分（图2a-c）。基于这一策略，CD8+ T 细胞被划分为 CD8_Tnaive、CD8_Ttsm、CD8_Tpex、CD8_Texint、CD8_Texterm 和 CD8_Texeff 六类，并显示出清晰的标志基因和功能评分差异（图2d-e）。从空间来源看，CD8_Tnaive、CD8_Ttsm 和 CD8_Tpex 更集中于 TdLNs，而 CD8_Texint、CD8_Texeff 和 CD8_Texterm 主要位于 TME（图2f-g）。这说明 TdLNs 更像前体细胞储存库，而肿瘤内则富集更分化的耗竭效应群体。mIF 进一步在肿瘤原位验证了 TIM-3+GzmB+CD8+ 的 CD8_Texeff 表型，并在 TdLNs 中验证了 PD-1+TCF-1+ 的 CD8_Tpex 表型（图2h-i）。拟时序分析则将这些状态连接为连续轨迹，显示 CD8+ T 细胞可能由 naive/Tpex 状态逐步进入 CD8_Texint，随后分化为 Texeff 或 Texterm 两条分支（图2j）。

在确定 CD8+ T 细胞存在多个耗竭状态后，研究团队进一步证明 CD8_Texeff 并不是普通的终末耗竭细胞，而是一类保留强效应功能的肿瘤反应性群体。差异基因分析显示，CD8_Texeff 同时高表达 GNLY、GZMB、GZMA、NKG7、PRF1 和 IFNG 等细胞毒分子，以及 PDCD1、LAG3、CTLA4、TIGIT 和 HAVCR2 等检查点分子，说明其兼具“耗竭表型”和“杀伤能力”（图3a）。通路富集结果进一步支持其活化和细胞毒功能，转录因子分析则提示 BATF 和 ZNF121 可能参与调控这一状态（图3b-c）。在组织层面，mIF 显示 CD8_Texeff 在肿瘤中心和侵袭边缘富集，提示其参与局部抗肿瘤反应（图3d）。随后，研究团队用流式细胞术定义 TCF-1-PD-1hiGzmB+CD8+ T 细胞，并验证其可产生 IL-2、TNF-alpha 和 IFN-gamma；同时约 80% 的 MKI67+CD8+ T 细胞属于 CD8_Texeff，说明该群体兼具效应和增殖潜能（图3e-h）。进一步的 TCR、克隆扩增、NeoTCR8 评分和 CXCL13 表达分析显示，CD8_Texeff 是肿瘤特异性和克隆扩增水平最高的 CD8+ T 细胞状态（图3i-o）。

作者明确 CD8_Texeff 的功能后，进一步追问：这类细胞是否解释了 MSI 与 MSS CRC 的免疫差异。结果显示，MSI CRC 的 TdLNs 中 CD8+ T 细胞更偏向 CD8_Tpex 等活化/前体耗竭状态，而 MSS CRC 的 TdLNs 中则更多保留初始状态（图4a-b）。进入 TME 后，两类肿瘤的差异更加明显：MSI CRC 中 CD8_Texeff 显著富集，而 MSS CRC 中 CD8_Texterm 比例更高，mIF 也验证了 MSI 肿瘤及其侵袭边缘存在更多 GzmB+TIM-3+CD8+ T 细胞（图4c-f）。临床分层分析显示，CD8_Texeff 在早期 CRC 中更丰富，晚期 MSS CRC 中明显减少，TCGA-COAD 中的 CD8.Texeff 评分也与分期和 MSI/MSS 状态相关（图4g-i）。进一步的生存分析和免疫治疗队列显示，CD8_Texeff 相关评分越高，患者预后和 ICB 应答越好（图4j-m）。基于 GZMK、CXCL13 和 CD8A 构建的 IP score 也能预测多癌种免疫治疗反应和无进展生存；在 MSS CRC 队列中，IHC-IP score 的预后预测能力优于单独 CXCL13（图4n-t）。这提示 CD8_Texeff 不仅是免疫活化标志，也具有潜在临床转化价值。

除 T 细胞外，MSI CRC 的髓系细胞也呈现更强免疫活化状态。首先，在 TME 中，MSI DCs 高表达 HLA-A、HLA-B、CXCL9 以及 STAT1、OAS1、IRF1、IRF7、IRF8、ISG15 等 ISG，并富集细胞因子介导的细胞通讯和免疫反应通路，提示其抗原递呈和 T 细胞招募能力增强（图5a-c）。类似的差异也出现在 TdLNs：MSI 活化 DCs 表达更多抗原加工递呈和 T 细胞活化相关基因，而 MSS 活化 DCs 更高表达 CCL17、CCL22 和 CD274，更偏向 Treg 招募和免疫抑制表型（图5d-f）。随后，研究团队进一步分析巨噬细胞，发现 MSI TME 中巨噬细胞同样高表达趋化因子和抗原递呈相关分子，并富集 T 细胞趋化通路（图5g-h）。分群后，CXCL10+ 巨噬细胞（Mac_CXCL10）在 MSI TME 中显著增加（图5i-j）。细胞通讯分析显示，Mac_CXCL10 可通过 CXCL9/10/11-CXCR3 和 CXCL16-CXCR6 轴与 CD8_Texeff、CD4_Texeff 发生互作（图5k-l）。空间分析进一步显示，Mac_CXCL10 主要位于肿瘤-间质边界，并与 CD8_Texeff 高度共定位，提示其可能负责把效应耗竭 T 细胞招募进 TME（图5m-o）。

最后，研究团队从肿瘤细胞本身出发，分析 MSI 和 MSS CRC 是否具有不同的内在免疫调控程序。NMF 将肿瘤细胞分为 9 个亚群和 8 个转录程序，其中 MSI 肿瘤细胞主要富集 T 细胞活化、IFN-gamma 和 TNF-alpha 反应相关程序，而 MSS 肿瘤细胞更偏向应激反应和增殖程序（图6a-d）。进一步分析差异基因发现，MSI 肿瘤细胞上调 MHC-II 分子、CXCL10 等干扰素响应相关基因，提示其不仅是被免疫细胞浸润的对象，也可能主动参与抗原递呈和 T 细胞趋化（图6e-f）。对应地，MSI 肿瘤细胞具有更高的干扰素响应评分和 cGAS-STING 活化评分，IHC 也验证 MSI CRC 中 STING 蛋白表达更高，说明 cGAS-STING-IFN 轴可能是 MSI TME 免疫活化的重要来源（图6g-j）。与之相反，MSS 肿瘤细胞更高表达 HSPA1A 和 PLA2G10，其中 PLA2G10 与 T 细胞排斥相关（图6e-f）。IHC 进一步显示 PLA2G10 在 MSS CRC 中表达更高，并且 PLA2G10 高表达患者的 CD8+ T 细胞浸润更低（图6k-m）。因此，MSI 肿瘤细胞通过 cGAS-STING-IFN 程序强化免疫活化，而 MSS 肿瘤细胞则更偏向低炎症、低 T 细胞浸润的免疫排斥状态。

本研究系统比较了 MSI 和 MSS CRC 的 TdLNs 与 TME，发现 MSI CRC 中富集一类肿瘤反应性 CD8_Texeff 细胞。该细胞群虽然具有耗竭表型，却保留细胞毒性、增殖能力和肿瘤特异性，并与 TLS 形成、良好预后和免疫治疗反应相关。机制上，MSI CRC 的 TdLNs 提供了更有利的免疫基础，包括更多 CD8_Tpex/CD4_Tpex、更少 Treg 和更强 DC 抗原递呈能力。进入 TME 后，CD4_Texeff 细胞、Mac_CXCL10、ISG 阳性 DCs、TLS 结构和肿瘤细胞 cGAS-STING-IFN 程序共同支持 CD8_Texeff 的募集、分化和维持。相反，MSS CRC 的 TdLNs 和 TME 更偏免疫抑制，肿瘤细胞还更高表达 PLA2G10 等与 T 细胞排斥相关的分子，可能限制 CD8_Texeff 形成。总体而言，本文提出 TdLNs-TME 协同调控模型，强调 TdLNs 不是单纯的转移评估结构，而是塑造肿瘤免疫生态和免疫治疗反应的重要节点。