文献解读|J Hepatol（40.1）：Setdb1抑制肝细胞癌中的抗肿瘤免疫和三级淋巴结构

三级淋巴结构（TLS）是异位淋巴组织，形成于非淋巴组织中，例如肿瘤微环境和慢性炎症部位。在癌症中，TLS通过促进多种免疫细胞的募集和激活，在抗肿瘤免疫中发挥着重要作用。淋巴毒素通路已证实能够激活CXC基序趋化因子配体13（CXCL13）、CC基序趋化因子配体19（CCL19）和CC基序趋化因子配体21（CCL21）等趋化因子的表达，并促进免疫细胞募集形成TLS。TLS为抗原呈递细胞（APC）提供了一个平台，使其能够有效地将肿瘤抗原呈递给T细胞，并促进肿瘤特异性T细胞应答的产生。在胰腺癌中，白细胞介素33（IL-33）通过激活2型固有淋巴细胞诱导TLS的形成。重要的是，TLS支持B细胞成熟为浆细胞，从而产生针对肿瘤相关抗原的抗体。近年来，不同类型癌症的空间转录组分析提供了大量数据，但目前对TLS形成的调控机制的了解仍然有限。已有报道表明，SET结构域分叉组蛋白赖氨酸甲基转移酶1(Setdb1)通过CD8+ T细胞参与黑色素瘤抗肿瘤免疫的调控。然而，Setdb1是否调控肿瘤微环境（TME）中其他免疫细胞的功能尚不清楚。

为了研究Setdb1在肝细胞癌（HCC）抗肿瘤免疫中的作用，研究团队首先检测了其对肿瘤生长的影响。他们利用CRISPR技术在Akt/NRAS(G12V) HCC模型中敲低了Setdb1（图1A-F）。Setdb1的减少显著抑制了肿瘤生长和Afp表达，延长了动物的生存期，减轻了肝脂肪变性，并恢复了组织结构（图1B-F）。作为对照，将CRISPR/sgSetdb1注射到正常C57小鼠体内未引起明显变化（补充图S1A-B）。他们进一步在Setdb1 loxp/+；Alb-Cre小鼠模型中进行了测试，该模型是通过水动力注射Akt/NRAS(G12V)实现的。结果表明，Setdb1肝脏条件性敲除（Setdb1 CKO）也抑制了HCC的生长（图1G-H）。TCGA分析结果表明，与邻近组织相比，Setdb1在HCC组织中高表达，且其高表达与较差的生存率相关。这些结果表明Setdb1在HCC中发挥致癌作用.

为了探究Setdb1调控HCC的潜在机制，他们首先对图1B中的肿瘤组织进行了转录组分析(RNA-seq)（图S2A）。出乎意料的是，生物信息学分析显示，sgSetdb1组中大量免疫球蛋白相关基因表达上调；与此一致的是，基于GSEA分析显示，sgSetdb1样本中免疫球蛋白生成通路显著富集（图2A-B，图S2B-C）。虽然B细胞在肿瘤组织中较为常见，但免疫球蛋白的高表达却并不常见。为了验证这一结果，通过RT-PCR检测了组织中IgG mRNA的表达水平，并通过ELISA检测了血浆中IgG蛋白的表达水平（图2C-D，图S2D），结果均证实了上述观察结果。

由于IgG的产生通常与B细胞成熟为浆细胞相关，他们利用RNA-seq数据进行了CIBERSORT反卷积分析，以评估免疫细胞的浸润情况。结果显示，在Setdb1敲低的肝脏中，浆细胞和树突状细胞显著上调（图2E，图S2E）。苏木精-伊红（HE）染色显示，免疫细胞常聚集在Setdb1敲低样本的特定区域（图2F）。IF染色显示，IgG、CD20和CD3（分别为浆细胞、B细胞和T细胞的标志物）在上述位点富集（图2G）。从Setdb1敲除Akt/NRAS小鼠中分离的血清能够在体外识别Hepa1-6肝癌细胞，并在体内抑制肿瘤生长。这些结果表明，Setdb1缺失组织中的免疫细胞形成了类似 TLS 的结构。

为了验证Setdb1缺失是否诱导HCC中TLS的形成，他们进行单细胞空间转录组分析。该技术能够对细胞中的转录本进行空间标记，然后利检测转录本。他们使用已发表的标记物或定义的标记物预测TLS区域，这两种方法均在sgSetdb1组织中检测到了TLS区域（图3A-B）。细胞群注释显示，sgSetdb1组织中的恶性细胞显著减少，但B细胞和T细胞的比例似乎没有显著变化（图3C-D）。遗憾的是，检测到的B细胞和T细胞的比例相对较低，仅占总细胞的2-3%左右，这使得无法进行亚类分析。接下来，他们尝试将免疫细胞在所分析的组织中进行空间定位。虽然免疫细胞数量相对较少，但成功地识别出B细胞、树突状细胞（DC）和T细胞聚集TLS中（图3D）。B细胞和DC位于TLS的中间层；而T细胞和髓系细胞则位于外层。这与TLS的结构描述相符。结合之前通过多重染色和血清过继实验获得的证据（图2），这些结果有力地证明了Setdb1抑制AKT和NRAS驱动的HCC中TLS的形成，而通过CRISPR敲低Setdb1则会诱导HCC中TLS的形成和免疫球蛋白的产生。

为了研究Setdb1表达与临床样本中TLS的相关性，他们首先分析了TCGA-LIHC队列，发现肿瘤组织中Setdb1高表达与较低的TLS相关基因特征评分显著相关。此外，他们分析了HE和IF染色的HCC标本，并将其分为TLS+组和TLS-组。然后，进行了Setdb1的IHC染色，结果表明，TLS-组中Setdb1的表达显著高于TLS+组（图3E）。这些数据表明，Setdb1的表达与临床HCC患者样本中TLS的形成呈负相关。

为了研究Setdb1基因敲除是否与免疫疗法具有协同作用，通过注射sgSetdb1或Ctrl Hepa1-6细胞建立了皮下HCC模型，并用抗PD-L1抗体或同型对照抗体进行治疗（图3F）。他们将抗PD-L1抗体的剂量降低至80 μg/次（制造商建议剂量为200 μg/次，共注射三次）。结果显示，Setdb1基因敲除和抗PD-L1抗体均能抑制肿瘤生长，联合治疗进一步缩小了肿瘤体积（图3G-H）。在部分小鼠中，未观察到明显的肿瘤结节（图3G）。有趣的是，在Setdb1基因敲除小鼠的肿瘤中未观察到TLS，但在联合治疗小鼠的肿瘤边缘观察到了TLS（图3I）。

为了探究TLS形成的潜在机制，他们首先研究了Setdb1缺失是否通过胞质DNA激活干扰素。利用一种识别dsDNA的抗体，发现Setdb1敲除的Hepa1-6细胞中产生了胞质dsDNA（图4A）。RT-PCR结果显示，Setdb1敲除也增强了Hepa1-6细胞或正常肝细胞系AML12中Il6、Ifn-β和Isg15的表达，这些基因可由DNA病毒HSV-1或合成的dsDNA激活（图4B-C）。敲低Sting1 / Mita抑制了Setdb1缺失增强的基因表达，表明该过程依赖于cGas通路（图4D）。Zbp1是IFN-β的靶基因，与坏死性凋亡相关。Setdb1敲低导致培养细胞和鼠肝中Zbp1表达上调（图4E）；免疫组化染色显示，TLS中磷酸化MLKL水平升高（图4F-G）。这些结果表明，TLS内细胞可能发生坏死性凋亡，这可能是通过cGas通路诱导的Zbp1介导的。

在生发中心，趋化因子（如CXCL12/13）及其受体CXCR4/5对B细胞成熟至关重要。已有报道指出，在肺部炎症模型中，cGAS通路可通过CXCL13诱导TLS的形成。为了研究TLS形成的潜在机制，他们用HSV-1处理野生型和Setdb1敲低的Hepa1-6细胞，发现HSV-1激活了所有四个基因的表达，而Setdb1敲低进一步增强了这些基因的表达（图5A）。在正常肝细胞系AML12中，HSV-1和Setdb1敲低也引起了类似的现象（图5B）。有趣的是，用 RNA 病毒仙台病毒 (SeV) 处理后，Ifn-β和Il6激活，但Cxcl12未激活，这表明Cxcl12的诱导表达依赖于 DNA 介导的通路。在两种细胞系中，B 细胞相关基因的激活表达均依赖于 STING/MITA（图 5C-D）。TBK1 抑制剂 MRT67307 或 STING/MITA 抑制剂 H151 均能抑制增强的基因表达（图 5D）。这些结果表明，cGas 通路对于肝细胞中上述基因的表达至关重要。

随后，他们检测了动物模型中的基因表达。RT-PCR结果表明，Setdb1敲低增加了肿瘤组织中Cxcl12和Cxcr5的表达，但未影响Cxcl13和Cxcr4的表达；在正常肝脏中，Setdb1敲低没有明显影响（图5E）。他们发现肝组织中Cxcr5的水平非常低，接近背景水平（图5E）。结合单细胞转录组学数据，这些数据共同表明，在上述四个基因中，Cxcl12是Setdb1敲低在体内诱导的主要基因（图5F）。Cxcl12主要在胆管细胞、成纤维细胞、中央静脉周围和门静脉周围肝细胞以及恶性细胞中上调（图5F）。Cxcl12在星状细胞中高表达，但在Setdb1敲低后其表达量并未发生显著变化（图5F）。他们随后研究了B细胞与表达Cxcl12的细胞之间的潜在关系，发现Setdb1敲低的肝脏中，Cxcl12阳性的中央/门静脉周围肝细胞与B细胞之间的距离缩短（图5G），提示中央/门静脉周围肝细胞中Cxcl12的上调在B细胞的募集和成熟过程中发挥重要作用。cGas通路下游的坏死性凋亡基因Zbp1的表达模式与Cxcl12不同，在Setdb1敲低后主要在成纤维细胞和恶性细胞中上调，表明组织微环境中存在复杂的转录调控机制。为了进一步验证cGas通路及其下游基因的作用，在Akt/NRAS小鼠中同时敲低了Sting/Mita和Setdb1。与sgSetdb1组相比，共敲低组肿瘤数量似乎略有增加，但差异并不显著。重要的是，共敲低组中TLS的数量显著减少（图5H），表明cGas通路对于模型中TLS的形成至关重要。此外，在原位Hepa1-6模型中，他们发现Setdb1敲低诱导的TLS中的B细胞信号在Cxcl12敲低后消失，同时肿瘤体积增大（图 5 I-J）。在Setdb1 / Cxcl12双敲除肿瘤中， IgG表达也显著下调。这些结果进一步支持 CXCL12 在Setdb1缺失诱导的 TLS 中发挥关键作用。

已知Setdb1缺失会激活内源性逆转录病毒（ERV）的表达。他们分析了Akt/NRAS模型的RNA-seq数据，发现Setdb1敲低增加了54个逆转录转座子的表达，其中大部分是ERV（图6A）。随后，他们使用RT-PCR验证了动物组织和细胞中ERV的表达（图6B）。通常，ERV的激活与H3K9me3的减少有关。有趣的是，在部分诱导的ERV的基因组位点上，并未观察到显著的H3K9me3下调；相反，观察到H3K27ac的升高（图6C-D）。 Setdb1 可能不仅通过催化 H3K9me3 来抑制 ERV 活性，而且还通过抑制某些基因组位点上的 H3K27ac 来抑制 ERV 活性。

ERV表达与抗肿瘤免疫反应相关。单细胞分析显示，Setdb1敲除后ERV表达上调主要发生在Akt/NRAS阳性肝脏的恶性细胞、胆管细胞、中央静脉周围和门静脉周围肝细胞中，其表达模式与Cxcl12相似但不完全相同（图6E）。空间分析显示，在sgSetdb1组织中，表达ERV（如RLTR6B-Mm和RLTR6-int）的B细胞和恶性细胞倾向于富集于TLS位点；而在对照样本中，它们呈随机分布（图6F）。免疫球蛋白和ERV，例如RLTR6-int、RLTR6B-Mm和MMERVK10C-int的空间分析也支持它们倾向于紧密定位于TLS区域周围（图6G）。考虑到先前报道TLS可产生识别ERV的抗体，这提示ERV可能作为肿瘤特异性新抗原，刺激TLS中B细胞的成熟和抗体的产生.

本研究在多种肝细胞癌模型中敲除了Setdb1基因，包括Akt/NRAS和Myc/CTNNB1流体动力学模型、Hepa1-6原位和皮下模型。采用空间转录组学和多重染色技术验证了TLS的激活。Setdb1缺失产生胞质DNA并激活cGas通路，进而增加Cxcl12和Zbp1的表达。Cxcl12在肝细胞和癌细胞中均上调，并促进B细胞的募集和成熟。Zbp1在恶性细胞中激活，并在TLS中诱导坏死性凋亡。Setdb1缺失还增加内ERV的表达，这些ERV可能作为新抗原促进B细胞成熟。本研究发现了一条涉及 cGas/Cxcl12 的 TLS 形成新通路，这将有助于深入研究抗肿瘤免疫的机制调控。