文献解读|J Hepatol（40.1）：肝小管周围细胞染色质重塑通过CYP450活性调节MASH

富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5 (Lgr5) 是活跃自我更新组织中干细胞的标志物。有趣的是，在自发增殖能力较低的组织（例如肝脏）中也检测到了Lgr5+细胞。最初，人们认为这些Lgr5+肝细胞具有肝脏干细胞的功能，并且在稳态条件下不存在。然而，当研究人员证明所采用的基因小鼠模型的固有局限性导致了这些早期解释时，这种观点很快受到了挑战。随后的研究证实，包括Lgr5+细胞在内的中央周肝细胞在实质稳态期间的肝脏再生中仅发挥有限的作用，其中Lgr5+肝细胞主要负责维持其自身谱系。在代谢性肝病中，例如代谢功能障碍相关性脂肪肝病（MASLD）和脂肪性肝炎（MASH），脂质会在整个肝脏中积累；然而，不同区域肝细胞对代谢应激的反应仍知之甚少。

本研究中，研究团队通过将Lgr5-CreERT2小鼠与H11-CAG-LSL-tdTomato报告小鼠（Lgr5CreERT2; H11-RFP）交配，获得可在他莫昔芬处理后对Lgr5+细胞进行tdTomato荧光标记的谱系追踪小鼠，以监测Lgr5+细胞数量的动态变化（图1A）。随后，小鼠喂食缺乏胆碱的氨基酸限定型高脂饮食（CDAA）4周（图1A），该方案常用于诱导MASH。在CDAA诱导的MASH进展过程中，HE染色显示脂滴退化现象随CDAA喂养时间延长而加重（图1B）。脂滴沉积的定量分析（以下简称“面积百分比”）也呈现出一致的增加趋势（图1C）。相比之下，实验期间Lgr5+细胞的比例在整个过程中保持稳定，约为5%（图1B-C），表明Lgr5+肝细胞群体在稳态及MASH发展过程中均得以维持。

接下来，他们评估了Lgr5⁺肝细胞的功能变化。对肥胖患者公开的单细胞转录组分析（scRNA-seq）数据进行分析发现，Lgr5⁺肝细胞中SWI/SNF复合物相关特征显著富集，提示SWI/SNF复合物可能参与肝脏代谢功能障碍（图S1A-B）。由于SWI/SNF复合物由多个亚基组成，他们选择了DPF2——唯一广泛表达的BAF45亚基——进行进一步研究。他们建立了Lgr5+-肝细胞特异性Dpf2敲除小鼠（Lgr5-CreERT2；Dpf2fl/fl）,标记为Dpf2ΔLgr5，并与Lgr5CreERT2；H11-RFP小鼠（Dpf2ΔLgr5；H11-RFP）进行交配以进行追踪。RFP（tdTomato）和DPF2的共免疫染色证实了在Lgr5+肝细胞中Dpf2的特异性敲除（图1D）。组织学显示，野生型（WT）与Dpf2ΔLgr5小鼠在基线阶段无显著差异（图S1C-L）。然而，在食物摄入量和体重方面相似的情况下，Dpf2ΔLgr5小鼠在CDAA饮食下前四周出现严重的肝脂肪变性（图1E-G）。

Lgr5+肝细胞中Dpf2的缺失会损害肝脏代谢功能，这引发了一个问题：在该细胞群中过表达Dpf2是否能够预防MASH？

为了解决这个问题，他们构建了一个腺相关病毒8型（AAV8）系统，用于在Lgr5+肝细胞中选择性地过表达Dpf2。该病毒命名为AAV-DIO-Dpf2，它采用了一种Cre依赖性的双floxed反向开放阅读框（DIO）设计。在没有Cre重组酶的情况下，Dpf2编码序列保持反向排列，因此不进行转录。只有在表达CreERT2的细胞中，并且只有在给予他莫昔芬后，Cre介导的重组才会将Dpf2序列反转为正确的方向，从而使其能够表达。因此，虽然AAV8能够有效地转导肝细胞，但Dpf2的表达仅限于CreERT2阳性细胞（图1H）。他莫昔芬给药后，感染AAV-DIO- Dpf2的Lgr5CreERT2小鼠表达FLAG标记的Dpf2。在CDAA饮食处理前，共免疫染色证实了中央静脉周围有效的FLAG-Dpf2表达（图1I）。接受AAV-对照组或AAV-DIO-Dpf2治疗的CDAA喂养小鼠的体重无显著差异（图S1M）。Western blot分析进一步表明，AAV-DIO-Dpf2的表达主要局限于肝脏，在肠道或其他器官中检测到的FLAG信号极少（图S1N）。重要的是，AAV-DIO-Dpf2感染并未改变肝脏整体Dpf2水平（图S1O）。功能上，Lgr5+肝细胞中Dpf2的过表达显著改善了MASH水平，HE和油红O染色证实了这一点（图1J-K）。CDAA喂养后，中央周围肝细胞中DPF2水平持续升高（图S1P-Q）。有报道称CDAA饮食会诱导肝细胞死亡，但在CDAA饮食喂养的AAV对照组和AAV-DIO-Dpf2感染小鼠的肝脏切片中，仅检测到少量凋亡的肝细胞（图S1R-S）。这些结果表明，Lgr5+肝细胞中的Dpf2能够保护肝脏免受CDAA诱导的MASH损伤。

接下来，他们研究了Dpf2在Lgr5+肝细胞中MASLD发展过程中的作用。他们给Dpf2ΔLgr5小鼠喂食果糖-棕榈酸-胆固醇（FPC）饮食——这是一种成熟的诱导小鼠MASLD的模型——持续9天。虽然肝脏体积和食物消耗量与野生型小鼠相当，但观察到肝脏脂肪变性和脂滴退化程度轻度增加。

他们推测，延长FPC治疗时间可能会加剧两组小鼠之间的差异。事实上，在喂食FPC饮食28天后，Dpf2 ΔLgr5小鼠的肝脏体积（图2A）和肝脏/体重比（图2B）均显著增加。值得注意的是，其食物摄入量未受影响（图2B）；然而，如H&E染色和油红O染色所示，肝脏内可见明显的脂滴积累（图2C-D）。此外，与喂食FPC的野生型小鼠相比，Dpf2 ΔLgr5小鼠的血清丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶水平升高（图2E），并且炎症基因和胶原相关基因的表达持续高表达（图2F-G）。与这些观察结果一致，在喂食FPC 42天后，Dpf2ΔLgr5小鼠的MASLD症状仍然比野生型（WT）小鼠更为严重。

为了评估WT和Dpf2ΔLgr5小鼠在MASLD发展过程中的代谢功能，他们接下来比较了喂食FPC饮食28天和12周后的肝脏组织病理学变化。在WT小鼠中，喂食FPC 12周后脂质沉积面积较28天时显著增加，但尚未达到Dpf2ΔLgr5小鼠喂食28天后的水平。相反，Dpf2ΔLgr5小鼠在28天和12周时均表现出相似的脂滴沉积程度。此外，WT小鼠在12周时肝脏炎症和胶原沉积的严重程度较28天时显著增加，而Dpf2 ΔLgr5小鼠在此期间未观察到进一步加重。此外，天狼星红染色显示，在WT和Dpf2ΔLgr5小鼠中，12周时纤维化程度均略有增加。值得注意的是，当FPC喂养延长至12周时，WT和Dpf2 ΔLgr5小鼠的体重没有显著差异。综上所述，这些结果表明，在Lgr5+肝细胞中敲除Dpf2可使FPC诱导的MASLD进展加速8周以上。

由于Lgr5也在小肠和结肠干细胞中表达，因此Dpf2ΔLgr5小鼠中Dpf2的缺失可能也会影响Lgr5+肠道细胞。然而，肠道切片分析显示，在接受他莫昔芬治疗7天或28天后， Dpf2ΔLgr5小鼠与野生型小鼠之间，H&E染色以及Ki67和cleaved-caspase 3的免疫组织化学(IHC)染色结果均无显著差异。为了排除肠道Dpf2缺陷对肝脏代谢的潜在影响，他们使用了一种携带DIO- Dpf2-FLAG构建体的AAV8病毒，该病毒具有很强的肝细胞嗜性（图S1N）。将Lgr5CreERT2或Dpf2 ΔLgr5小鼠感染AAV-DIO-Dpf2病毒，经过2周的潜伏期后，给予他莫昔芬以诱导Dpf2在Lgr5 +肝细胞中特异性表达，而非在Lgr5+肠道干细胞中表达。再过一周后，这些小鼠接受为期28天的FPC处理。AAV-Control组或AAV-DIO-Dpf2组WT和Dpf2ΔLgr5小鼠的体重相似。在AAV-DIO- Dpf2组中，FLAG-DPF2在中央静脉周围表达（图2H）。共染色揭示了 Lgr5+肝细胞中 DPF2 的表达模式。在AAV-Control 感染的Dpf2 ΔLgr5小鼠中，大多数GS+细胞中缺乏 DPF2，但在 AAV-DIO-Dpf2感染的Dpf2 ΔLgr5小鼠中，这种缺失现象得到纠正。喂食FPC、感染AAV-Control的Lgr5 CreERT2或Dpf2 ΔLgr5小鼠的表型与未感染、喂食FPC的WT和Dpf2 ΔLgr5小鼠相似（图2 H），但感染AAV-DIO-Dpf2的小鼠免受严重的脂滴积累（图2H-I）。

为了探究Lgr5+肝细胞中Dpf2缺陷如何影响邻近细胞类型并导致MASLD进展过程中的不良后果，他们利用scRNA-seq技术在单细胞分辨率下探索了其潜在机制。为确保结果的可靠性，对喂食FPC的WT小鼠和Dpf2ΔLgr5小鼠的肝细胞进行了单细胞核转录组分析（snRNA-seq）和scRNA-seq实验。分别从snRNA-seq和scRNA-seq实验中获得了66846个细胞核和21377个细胞。在保留的88223个细胞的数据集中，基于已知的标记基因（图3A），鉴定了10种细胞类型，包括肝细胞、内皮细胞、T细胞、单核细胞、库普弗细胞、B细胞、胆管细胞、树突状细胞和中性粒细胞。根据分区标记，肝细胞进一步分为四个亚型，其中包括Lgr5+肝细胞。在WT组和Dpf2 ΔLgr5组中，主要细胞类型的比例相似。他们还发现，Lgr5+肝细胞的比例低于5% ，这与之前的免疫染色结果一致（图1B）。有趣的是，在Dpf2ΔLgr5小鼠中，脂肪变性似乎广泛存在（图2C），提示Lgr5+肝细胞可能影响其他细胞类型。

鉴于中央周Lgr5+肝细胞主要负责营养物质和外源性物质的代谢，他们推测Lgr5+肝细胞可能通过代谢物与其他细胞类型进行通讯。为了验证这一推测，利用MEBOCOST（一种用于推断代谢物介导的细胞间通讯事件的计算工具）来推断可能的代谢物外排、受体和靶细胞。

Lgr5+肝细胞可能通过全反式维甲酸（atRA）、9-顺式维甲酸和13-顺式维甲酸（图3B）与1区和3区肝细胞进行通讯，这些物质是视黄醇代谢的产物。其中，atRA的活性最强，并已报道参与MASLD的发生发展。此外，代谢组学分析显示，在喂食FPC的Dpf2ΔLgr5小鼠的肝脏样本中，视黄醇（atRA的前体底物）的浓度下调（图3C）。

他们假设Lgr5+肝细胞通过atRA促进细胞间通讯。为了验证这一假设，他们利用质谱法定量分析了肝脏中atRA的水平，结果显示小鼠肝脏中atRA浓度显著降低（图3D）。为了验证这种缺陷的功能相关性，他们在小鼠的FPC饮食中添加了atRA。正如预期的那样，外源性atRA补充有效保护小鼠免受MASLD进展的影响，甚至减轻了WT对照组小鼠的脂滴积累（图3E-G）。虽然FPC饮食或atRA补充均未影响小鼠的食物摄入量，但在atRA处理的WT小鼠中观察到体重略有增加。此外，atRA处理显著下调了促炎和促纤维化（胶原相关）基因的表达（图3H）。总的来说，Lgr5+肝细胞内Dpf2介导的调控通过调节 atRA 水平来控制与更广泛的肝细胞群的细胞间通讯。

根据肝小叶内肝细胞与中央静脉或门静脉的空间邻近程度，将其划分为不同的区域。他们对FPC处理的WT和Dpf2ΔLgr5小鼠进行了空间转录组学分析，以揭示其空间机制。通过对空间转录组学图像中的肝脏切片进行H&E染色，发现FPC喂养的Dpf2ΔLgr5小鼠的肝脏切片中脂滴数量更多。基于已建立的标记基因，鉴定出三种主要细胞类型——肝细胞、胆管细胞和巨噬细胞。肝细胞根据中心静脉周围代谢和门静脉周围基因集以及经典的分区相关基因进一步分为四个亚型（图4A-B）。增殖标记分析证实， Lgr5+肝细胞中Dpf2的缺失并不影响肝细胞的整体增殖。值得注意的是， Dpf2ΔLgr5小鼠的脂肪酸代谢通路下调（图4C-D），这与HE染色结果一致（图2C）。

为了探究视黄醇酸降解的机制，他们对来自空间转录组学数据的肝小叶周围区域细胞和来自scRNA-seq数据的Lgr5+肝细胞进行了基因集富集分析。两项分析均显示视黄醇代谢通路上调（图4 E-F）。KEGG视黄醇代谢通路的可视化进一步表明，视黄醇代谢活性主要富集于肝小叶周围区域，在1区也有轻微增加（图4 G）。值得注意的是，编码负责全反式视黄醇（atRA）分解代谢酶的细胞色素P450家族2亚家族（Cyp2）基因在白色边界所界定的肝小叶周围区域内显著上调（图4 H）。点阵图分析一致表明，大多数上调的Cyp2基因富集于Lgr5+肝细胞中，在3区肝细胞中略有增加（图4I）。在人类中，CYP2C9是小鼠Cyp2c29的直系同源基因，CYP2C19是Cyp2c50和Cyp2c37的直系同源基因。对喂食FPC饮食的WT和Dpf2ΔLgr5小鼠的肝脏切片进行CYP2C9和CYP2C19的免疫组化染色显示，Dpf2ΔLgr5小鼠中这两种蛋白的表达均显著增加，且染色主要定位于中央静脉附近（图4J）。为了进一步确定Dpf2缺失是否导致局部或全身性atRA耗竭，他们分析了空间转录组学数据，以评估不同肝脏区域中视黄醇信号传导的活性。这些分析表明，在Dpf2ΔLgr5小鼠的肝脏中，视黄醇信号普遍降低。

他们利用来自正常肝脏和脂肪肝患者的连续肝脏切片，通过HE染色证实了脂肪肝患者肝脏中脂质蓄积增加（图4K），并通过IHC染色证实了CYP2C9表达上调（图4L）。此外，对来自正常肝脏和脂肪肝患者样本的公开空间转录组学数据进行分析（图4M）显示，脂肪肝患者肝脏样本中脂肪酸代谢通路下调（图4N），而视黄醇代谢和脂肪酸生物合成通路均上调（图4O）。同时，也检测到CYP2基因表达水平升高（图4P）。

scRNA-seq和空间转录组学分析揭示了视黄醇代谢通路的上调，但Dpf2在Lgr5+肝细胞中调控视黄醇水平的机制仍不清楚。鉴于Dpf2是BAF复合物的一个亚基，已知其可通过组蛋白修饰和染色质可及性调控基因表达，他们进行了表观基因组分析——使用ATAC-seq和CUT&Tag检测H3K4me3——以研究其功能。为了确定Dpf2是否在Lgr5+肝细胞中发挥特异性功能，他们从喂食FPC饮食的谱系追踪小鼠中分离出原代肝细胞，然后通过流式细胞技术分选出Lgr5+肝细胞。还分离了喂食FPC饮食的Dpf2 fl/fl和Dpf2ΔLiver小鼠的肝细胞。这些细胞用于ATAC-seq和CUT&Tag实验（图5A）。接下来，他们使用喂食FPC饮食的Dpf2 fl/fl小鼠的肝细胞对DPF2进行了CUT&RUN分析（图5B）。内源性ARID1A （GSE65167）的ChIP-seq数据也提供了佐证，ARID1A也是SWI/SNF复合物的重要亚基。

在Lgr5+肝细胞中敲除Dpf2后，Cyp2基因（如Cyp2c50、Cyp2c29和Cyp2c37）转录起始位点的H3K4me3水平和染色质可及性均升高（图5B）。相反，在Dpf2ΔLiver组中未观察到这种趋势，该组中H3K4me3和ATAC-seq信号与野生型肝细胞相比保持不变或降低（图5B）。由于Lgr5+细胞仅占肝细胞的约5%，因此全肝Dpf2缺失可能掩盖了Lgr5+亚群中特异性发生的表观遗传学改变。与此一致的是，与对照组相比，Dpf2ΔLgr5组中整体H3K4me3水平升高，而Dpf2ΔLiver组中整体H3K4me3水平略有降低（图5C）。尽管存在这些全基因组差异，但荟萃分析清楚地表明，在Lgr5+肝细胞中，Cyp2基因位点的平均H3K4me3和ATAC-seq信号强度显著增加（图5D）。这些数据共同证实了Dpf2在Lgr5+肝细胞中调控Cyp2基因染色质状态的细胞类型特异性作用。

为了验证细胞色素P450基因在FPC诱导的MASLD中的作用，他们每日用载体或强效CYP酶抑制剂柚皮苷处理WT或Dpf2ΔLgr5小鼠。值得注意的是，柚皮苷显著改善了MASLD的进展，表现为H&E染色和油红O染色的改善（图5 E–G），且不影响食物摄入量或体重。与WT对照组相比，柚皮苷处理组小鼠肝脏脂滴的染色强度略高，提示可能存在补偿性调节通路。此外，柚皮苷处理组中促炎和促纤维化（胶原相关）基因的表达显著下调（图5H-I）。

靶向维甲酸信号通路已在临床上展现出显著疗效。例如，急性早幼粒细胞白血病的标准治疗方案包括使用atRA联合蒽环类药物化疗。人体和动物研究均已阐明维甲酸信号通路与MASLD发病机制之间存在密切关联。

已知AMPK是能量供应和利用平衡的核心整合因子，其慢性失衡可能导致MASLD甚至MASH的发生。然而，atRA的保护作用是否依赖于AMPK尚不清楚。值得注意的是，数据揭示了1区肝细胞中AMPK信号通路的显著下调（图6A）。此外，Fasn的上调和Mlycd36 （均为AMPK靶基因）的下调进一步表明AMPK信号通路的激活减弱（图6B）。散点图中还鉴定出其他几个AMPK信号通路相关基因。AMPK靶基因的表达水平也进行了空间可视化（图6C-D）。通过scRNA-seq和空间转录组数据的联合分析，假设atRA以AMPK依赖的方式发挥其对MASLD的保护作用。

为了验证这一假设，他们构建了一个组成型活性 AMPKα1 (CA-AMPK) 载体，该载体表现出组成型磷酸化。通过尾静脉将 CA-AMPK 质粒以水动力法注射到小鼠体内（图 6E）。载体组和 CA-AMPK 处理组小鼠的体重相似。Western blot 分析显示，与野生型对照组相比，喂食 FPC 饮食的Dpf2 ΔLgr5小鼠体内磷酸化 AMPK 水平降低。然而，在 CA-AMPK 转染的小鼠中检测到 AMPK 磷酸化水平显著升高（图 6F）。GS、SOX9 和 FLAG 的共免疫染色也证实了 CA-AMPK 质粒成功转染到肝细胞中（图 6G）。值得注意的是，观察到在Lgr5+细胞所在的GS阳性区域未检测到过表达的CA-AMPK，表明在缺乏Lgr5表达的肝细胞中CA-AMPK的表达得以恢复。值得注意的是，Dpf2ΔLgr5小鼠中严重的MASLD水平可通过CA-AMPK过表达得到缓解，这可由H&E和油红O染色结果的改善所证实（图6 H-I）。在CA-AMPK注射组中，炎症相关基因显著下调，胶原相关基因也呈下降趋势。

此外，他们使用了 AMPK 激动剂 A-769662，它能促进 AMPK 磷酸化。每日向喂食 FPC 饮食的WT和Dpf2 ΔLgr5小鼠注射 A-769662 可显著减少脂滴积累（图 6 J-K）。他们进一步应用了一种由Gls2启动子驱动的区域特异性组成型活性 AMPK (CA-AMPK) 递送策略(AAV- Gls2-CA-AMPK)，从而实现了 CA-AMPKα1 在 1 区和 2 区肝细胞中的选择性重建。利用这种方法，在喂食 FPC 饮食的Dpf2ΔLgr5小鼠中观察到的代谢功能障碍在AAV- Gls2-CA-AMPK 转导后得到了显著逆转（图 6J-K）。此外，还观察到 atRA 处理的小鼠中 AMPK 的磷酸化增加，证实了 atRA 在促进 AMPK 磷酸化中的作用。

为了进一步证实Lgr5+肝细胞中的Dpf2通过 AMPK 依赖性方式抑制视黄醇分解代谢来保护小鼠免受 MASLD 的侵害，他们进行了一项互补的功能缺失实验，构建了 FLAG 标记的显性失活 AMPKα1 和 AMPKα2 (DN-AMPKs) 质粒，并通过尾静脉注射（图 7A）给小鼠。EGFP 免疫荧光染色证实质粒已成功转入肝细胞。还监测了小鼠的体重变化。出乎意料的是，在Dpf2ΔLgr5小鼠中，用 DN-AMPKs 转染后，由 atRA 减轻的严重 MASLD 症状并未得到逆转（图 7B-C）。虽然补充了atRA，但DN-AMPK转染小鼠体内炎症和胶原相关基因的表达仍然持续升高。在接受atRA治疗、喂食FPC饮食的WT和Dpf2 ΔLgr5小鼠中，DN-AMPK转染显著降低了AMPK的磷酸化水平（图7D）。

他们对同时接受 atRA 和 DN-AMPK 治疗的小鼠肝脏切片进行了 EGFP 和 BODIPY 的共染色。结果显示，在 DN-AMPK 表达（EGFP +）的区域特异性地检测到了 BODIPY 荧光强度的增加（图 7E），表明 DN-AMPK 表达的肝细胞及其周围区域的脂质积累增强。为了评估表达DN-AMPK的肝细胞是否能局部促进脂质积累，他们用DN-AMPK嵌合转染AML12细胞，并在转染后36、48和60小时进行油红O染色。在所有时间点，DN-AMPK组的脂质积累量均显著高于对照组。值得注意的是，对照组培养物中脂滴呈随机分布，而表达DN-AMPK的细胞（EGFP +肝细胞）在其周围区域表现出明显的脂滴局部富集。

这些结果共同表明，Dpf2在 Lgr5+肝细胞中的保护作用是通过抑制 atRA 降解而发挥的，从而使积累的 atRA 能够激活 AMPK 磷酸化并保护肝脏免受 MASLD 的损害。

本研究解析了空间上不同的肝细胞群的染色质调控，并证实罕见的Lgr5+肝细胞亚群中的Dpf2活性足以驱动代谢重编程和MASLD的进展。这些发现对肝脏研究和临床实践均具有重要意义，凸显了全肝基因操作或整体组学分析如何可能掩盖局限于空间特定细胞群的关键致病机制。从转化医学的角度来看，靶向染色质调节因子或类视黄醇代谢通路可能提供有效且安全的治疗获益；值得注意的是，atRA给药仍可在全肝水平上提供强大的保护或预防作用。虽然有严谨的小鼠遗传学、高分辨率转录组学和人肝组织验证的支持，但临床转化仍需在更大规模的人群队列和精心设计的患者研究中得到证实。