光交联肽自己"报出"身份：二氮杂环丙烷的固有可碎裂性，让 XL-MS 看清蛋白互作

一、XL-MS 的"老大难"：光交联又快又广，却读不清

交联质谱（cross-linking mass spectrometry, XL-MS）的思路很直观：往蛋白质体系里加入"分子胶水"（交联剂），把空间上靠近的两个残基永久连起来，再把蛋白消化成肽段送进质谱。哪两段肽、哪两个残基被连在了一起，反过来就告诉你这两个残基在三维空间里挨得有多近——于是你不必拿到完整结构，也能推断蛋白构象、蛋白复合物的拓扑、甚至瞬时的互作。

交联剂分两派：

• - 化学交联剂（如 BS3、SDA 类）：反应基团明确、化学可控，但只对少数残基（赖氨酸、羧基等）有偏好，覆盖面有限；
• - 光交联剂（如二氮杂环丙烷 diazirine 类）：经紫外激活后极其活泼，几乎不挑残基，能捕获化学交联剂碰不到的瞬时、弱、广覆盖的互作——这是它最大的魅力。

但魅力背后是痛点：光交联肽的谱图里混进大量来源不明的复合碎片，传统搜索器（如 pLink）常常把它们误判成普通 b/y 离子，结果就是交联位点 assignment 不准、假发现率高。换句话说，光交联"连得上"却长期"读不清"。这篇工作要解决的，正是这个卡了领域多年的解析难题。

二、意外发现：二氮杂环丙烷交联肽"天生"可碎裂

研究团队先盯上一个被忽略的现象。常用的光交联剂 SDA 带有一个 1-羰基-4-二氮杂环丙烷（1-carbonyl-4-diazirine） 基团（图 1a）。在 HCD（高能碰撞解离）碎裂时，这个基团所在的侧链并不会"老老实实"只产生主链 b/y 离子，而是会经历一连串反应：光激活先生成 diazo 中间体、脱氮，反向地，在质谱碎裂时交联肽断裂又会形成一个五元环中间体（图 1b）。

▲ 图1 质谱证实二氮杂环丙烷光交联肽"固有可碎裂"。a 常用光交联剂 SDA 含 1-羰基-4-二氮杂环丙烷基团；b 光激活经 diazo 中间体脱氮，而 HCD 碎裂时交联肽断裂会形成五元环；c、d 侧链碎片（c）与主链碎片（d）的潜在断裂键与模式，主链碎片以橙色（y）和绿色（b）着色，复合碎片分别以深红与深绿表示，配色方案贯穿全文；e SDA 交联肽的代表性 MS2 谱图。

关键的洞见来了：这种侧链碎裂不是噪声，而是结构特征。二氮杂环丙烷交联肽在侧链上会稳定地产生一类带侧链标签的"复合碎片"（composite fragments，如 βy、αb 等带 [sc]/[sz] 标记），而且这些侧链碎片的出现与肽骨架序列无关、具有高度可重复性。也就是说，同一个二氮杂环丙烷基团，无论挂在哪条肽上，都会贡献一组"标志性"的碎片离子——这正是后续"指纹识别"的基础。

三、sFFP：侧链碎片组成的"分子指纹"

团队把这类侧链碎裂特征正式命名为 sFFP（side-chain fragmentation fingerprint，侧链碎裂指纹）。它为什么有用？

在传统 XL-MS 搜索里，交联肽的主链 b/y 碎片负责"这条肽是哪条肽"，但侧链上的交联基团碎裂往往被当成干扰丢掉，或误当成主链碎片。sFFP 反过来给算法加了一条判据：这条肽上是不是真的带着二氮杂环丙烷交联基团、断在了该断的位置。

图 2 给了一个教科书式的对比：同一个谱，传统流程因为把复合碎片 βy9+[sc]（m/z 1078.64，相对强度 4.1%）误当成普通 βy9+、又漏掉了 βy9++（m/z 1146.64，相对强度 2.8%），竟把交联位点错指到一个"惰性"的甲硫氨酸（Met）上；而纳入 sFFP 后，这些侧链特征被正确解释，位点 assignment 立刻纠正。

▲ 图2 引入 sFFP 提升光交联 XL-MS 的精度与覆盖。a 传统搜索流程（左）与纳入 sFFP 的流程（右）对比；右例中传统方法因把复合碎片 βy9+[sc]（m/z 1078.64，相对强度 4.1%）误判为普通 βy9+、并漏掉 βy9++（m/z 1146.64，相对强度 2.8%），将交联位点错指到惰性的 Met；b 以 BSA 为模型（n = 889 个依据 pLink3 评分筛选的谱），整合侧链 sc/sz 型 sFFP 签名后的效果。

一句话总结 sFFP 的价值：它让"侧链上到底有没有交联、交联断在哪"成为可量化的鉴定依据，从而把交联位点的可信度和谱图利用率同时拉高。

四、从 ML 到规则：一张过滤器把假阳性打下去

有了 sFFP 特征，下一步是把它变成可用的分析流程。团队做了两层：

第一层，机器学习模型。 他们从 pLink3 搜索结果里抽取关键参数（主链/侧链碎裂特征 + PSM 信息），用随机森林建立分类器。训练集由"正库"（结构合规的交联）和"负库"（诱饵 decoy、污染物、超长交联）组成。特征重要性排序显示，谱图可重复性（PSM 数）、sz 碎片强度、主链 b/y 覆盖度是最关键的判别因子（图 3a、b）。对比之下，ML 模型显著降低了假阳性率（FPR）。

第二层，更实用的规则过滤器。 不是每个实验室都方便跑 ML。团队把 ML 学到的关键规律提炼成一套基于规则的过滤算法——只用几个 sFFP 相关的硬指标就能筛掉绝大多数假阳性，性能与全 ML 模型相当（图 3c、d）。这一点对方法落地很关键：它意味着只要照着规则改一改搜索后的过滤步骤，现有 XL-MS 平台（pLink 等）不用换、数据不用重采，就能直接受益。

▲ 图3 基于 sFFP 特征建立 ML 与简化规则过滤模型。a 从 pLink3 对数据集 PXD048452 的搜索结果中提取的关键参数（主链/侧链碎裂特征与 PSM 信息），训练集由正库（结构合规交联）与负库（诱饵、污染物、超长交联）构成；b 随机森林模型的特征重要性排序，谱图可重复性、sz 碎片强度与主链 b/y 覆盖度是关键判别因子；c 性能对比，ML 模型假阳性率（FPR）更低；d 简化规则模型与全 ML 模型性能相当。

五、BDG：一剂"按需交联"的双可切交联剂

光有解析方法还不够——如果想在活细胞里"现场"抓互作，交联剂本身得更好用。化学交联剂 BS3 反应慢、偏好赖氨酸；而光交联剂虽活泼，却难以在"想交联时才交联"的窗口里精确控制。

团队据此自研了一款同源双功能、双可切的二氮杂环丙烷交联剂 BDG（图 4a）：两端各带一个二氮杂环丙烷反应基团，中间是可控的连接臂。它的妙处在"双可切"——BDG 交联的肽段能在多个位点被 MS 碎裂（经 MS3 验证），侧链 sc/sz 型离子（如 β++[sc'] m/z 732.30，相对强度 100%；α++[sz'] m/z 687.39，相对强度 31.4%）还能进一步发生主链碎裂、生成复合 b/y 离子（图 4b）。

▲ 图4 二氮杂环丙烷同源双功能双可切光交联剂 BDG 的设计与验证。a BDG 两端均含二氮杂环丙烷基团；b BDG 交联肽可在多位点碎裂（MS3 验证），特征性 sc/sz 型离子（如 β++[sc'] m/z 732.30，相对强度 100.0%；α++[sz'] m/z 687.39，相对强度 31.4%）进一步主链碎裂生成复合 b/y 离子；c 整合 sc/sz 与 sc'/sz' 特征，把肽主链碎裂离子的最小覆盖率从 36.6% 提升到 48.6%，每张谱的最小碎片离子数从 6.4 提升，改善了谱图利用率。

实测收益很硬：整合 sc/sz 与 sc'/sz' 两套特征后，肽主链碎裂离子的最小覆盖率从 36.6% 提升到 48.6%，每张谱的最小碎片离子数也明显提升——意味着 BDG 不仅"连得上、读得清"，还把谱图信息榨得更干。与同类型交联剂（SDA、BS3）对比，BDG 的交联位点数量可比、覆盖更广，且得益于双可切设计，对长程、跨复合物的"超长交联（over-length cross-link）"尤其敏感。

六、实战一：HSP90β 应激下的四聚体"快照"

方法好不好，看实战。分子伴侣 HSP90β 已知以二聚体形式存在（PDB 8EOA），但它是否会在应激下形成更高阶组装，长期缺少直接证据。

团队用 SDA、BDG、BS3 三种交联剂处理 HSP90β，结果很说明问题：大量 SDA 与 BDG 交联涉及 N 端结构域（NTD）和 C 端结构域（CTD）的残基，用已知的二聚体结构根本无法解释（图 5a、b）。把这些"解释不了"的长程交联拿去做对接建模，HSP90β 二聚体之间能聚出四聚体——而且第 3 号聚类出的四聚体结构，能直接贴合 TRAP1 四聚体的冷冻电镜密度图（图 5c）。四聚体还能进一步组装成八聚体或更高阶结构。

▲ 图5 用光交联可视化 HSP90β 的寡聚状态。a SDA、BDG、BS3 得到的不同交联；大量 SDA 与 BDG 交联涉及 NTD 与 CTD 残基，无法用已知二聚体结构解释；b 交联（SDA 黄、BDG 绿）映射到 HSP90β 二聚体结构（PDB 8EOA；NTD 红、MD 灰、CTD 蓝）；c 基于二聚体间长程交联对接生成的四聚体模型的聚类与降维，展示 8 个主聚类的代表结构，其中第 3 聚类结构可贴合 TRAP1 四聚体的冷冻电镜密度图，四聚体还可进一步组装为八聚体或更高阶结构。

对做结构生物学的实验室而言，这等于用一份 XL-MS 数据，把"HSP90β 在应激下形成四聚体"这个此前只有间接证据的命题，坐实成了有残基级约束的结构模型。

七、实战二：活细胞里热应激如何重塑互作网络

更精彩的是 BDG 的活细胞（in-cell）应用（图 6）。团队用 BDG 在活细胞里做光交联，再用抗 HSP90 抗体 co-IP 富集 HSP90 的交联伙伴。关键观察：温度升高时，捕获到的交联数明显增多——其中许多长程交联同样无法用已知二聚体结构解释（图 6a）。把这些体内捕获的长程交联映射回体外建模的 8 个四聚体聚类，发现绝大多数与第 3 号四聚体结构一致（图 6b 热图），与体外结论互相印证。

▲ 图6 sFFP 流程用于活细胞光交联分析。a 经 BDG 交联、抗 HSP90 抗体 co-IP 富集到的 HSP90 交联；温度升高时交联数增多，且无法用已知二聚体结构（PDB 8EOA，红弧指示）解释；b 50 ℃ 下鉴定的长程交联映射到体外建模的 8 个结构聚类，热图显示多数与四聚体 #3 结构一致；c Circos 图展示光交联+co-IP 鉴定的 HSP90 与互作蛋白之间的跨蛋白交联，这些蛋白在人类蛋白质组搜索中排名前 30 PSM，交联密度在高温下显著上升。

用 Circos 图把 HSP90 与互作蛋白之间的"跨蛋白交联"铺开看（图 6c），HSP70、DDX3X 等一批伴侣/调控因子赫然在列，且交联密度随温度上升而显著增强——说明热应激不仅改变 HSP90β 自身的寡聚状态，还系统性地重塑了整个分子伴侣互作网络。这项研究顺带给出了 HSP70/HSP90/DDX3X 复合物的结构拓扑线索。

八、这项工作真正改变了什么

它把光交联 XL-MS 从"连得上"推进到"读得懂"。 过去二氮杂环丙烷交联肽的侧链复合碎片被视为噪声甚至误判来源；这项工作反手把它变成 sFFP 指纹，配合 ML 模型与可落地的规则过滤器，在不动既有搜索平台的前提下，同时提升了离子覆盖度和位点鉴定的可信度、压低了假阳性。

它给出了一种更趁手的交联剂范式。 BDG 的"双可切"设计不是炫技，而是实打实地把每张谱的碎片利用率抬了上去，又因其对长程交联敏感，特别适合抓瞬时、高阶的蛋白组装——HSP90β 四聚体就是例子。

它对结构生物学与互作组学都有杠杆效应。 对结构生物学家，XL-MS 现在能提供带残基级距离约束的模型，去补足冷冻电镜/晶体学覆盖不到的动态、瞬时状态；对做互作组学的实验室，BDG + sFFP 流程意味着可以在活细胞里、在温度等真实胁迫条件下，直接"拍"蛋白互作网络的重排。

它的边界也诚实。 方法依赖二氮杂环丙烷交联剂的光激活与碎裂规律，对非光交联体系需要另建指纹；规则过滤器的阈值目前是在特定数据集上优化的，跨平台迁移时仍需类似 Fig.3 的校准。但方向已经很明确：把"交联基团的碎裂特征"系统化地纳入搜索与过滤，是 XL-MS 走向更准、更广、更可复现的必经之路。

术语速查

• - XL-MS（交联质谱）：用化学"分子胶水"把空间邻近的残基连起来，再经质谱鉴定被连的肽段与残基，从而推断蛋白构象与互作拓扑的技术。
• - 光交联剂：经紫外激活后极度活泼、可捕获瞬时/弱互作的交联剂；二氮杂环丙烷（diazirine）类是代表。
• - 二氮杂环丙烷（diazirine）：本文交联剂的核心反应基团，光激活生成高活泼卡宾，几乎不挑残基。
• - sFFP（side-chain fragmentation fingerprint，侧链碎裂指纹）：二氮杂环丙烷交联肽在质谱中稳定产生的、与肽骨架无关的侧链复合碎片集合，可用来确认"交联基团是否真实存在、断在何处"。
• - 复合碎片（composite fragment）：同时携带侧链交联标签与主链片段信息的离子，如带 [sc]/[sz] 标记的 βy、αb；传统搜索易将其误判为普通 b/y。
• - HCD（高能碰撞解离）：一种主流质谱碎裂方式，本文中交联肽的侧链五元环碎裂即在此条件下观察。
• - BDG：本文自研的同源双功能、双可切二氮杂环丙烷交联剂，两端均含反应基团，可在多位点碎裂、对长程交联敏感。
• - over-length / 长程交联：跨越已知结构（如二聚体）无法解释距离的两个残基之间的交联，是推断高阶组装（四聚体、八聚体）的关键证据。
• - pLink / pLink3：常用的 XL-MS 搜索引擎，本文在其搜索结果之上整合 sFFP 特征做二次过滤。
• - co-IP（免疫共沉淀）：用抗体富集某蛋白及其互作伙伴，本文用于活细胞里富集 HSP90 的交联网络。
• - Circos 图：环状图，本文用于直观展示 HSP90 与多个互作蛋白之间的跨蛋白交联关系。

本文依据：Jiang Y., Zhao R., Mao P., Liang F., Lu X., Fan J., Zhang X. & Tang C.. Inherent MS-cleavability of diazirine photo-cross-links enables residue-level structural analysis. Nature Communications (2026) 17:6558. DOI: 10.1038/s41467-026-73272-0。