文献解读|Signal Transduct Target Ther（52.7）：小细胞肺癌的外在和内在特征以及治疗脆弱性的表征

小细胞肺癌（SCLC）是一种高度侵袭性的恶性肿瘤，占所有肺癌病例的15%，每年在全球造成27万患者死亡。由于手术治疗较少，导致缺乏用于深入研究疾病发病机制的标本。在SCLC中，已检测到抑癌基因（包括TP53和RB1）的功能缺失突变，但癌基因的高频功能获得性突变却鲜有报道。根据转录因子 Achaete-scute 同源物 1 (ASCL1, A)、神经源性分化因子 1 (NEUROD1, N)、POU 2 类同源框 3 (POU2F3, P) 和 Yes 相关蛋白 1 (YAP1, Y) 的表达以及炎症基因特征，SCLC在分子水平上可分为 SCLC-A、N、P、Y 和 I 型。在这些亚型中均检测到肿瘤内异质性 (ITH) 增加和免疫抑制性肿瘤微环境 (TME)。虽然免疫疗法已广泛应用于临床，但所有分期 SCLC 患者的 5 年生存率仍低于 7%。因此，仍需开展多组学研究，以识别癌基因和分子亚型中高频的功能获得性改变，从而优化治疗方案。

为了深入研究小细胞肺癌（SCLC）的肿瘤发生机制和治疗靶点，研究团队收集了来自中国8个城市10家医院的314例患者的配对肿瘤组织和正常组织标本。其中，300例（95.5%）诊断为SCLC，14例（4.5%）为混合型SCLC。从人口统计学特征来看，237例（75.5%）为男性，77例（24.5%）为女性。共有150例（47.8%）年龄小于60岁，164例（52.2%）年龄在60岁及以上。在这些患者中，208例（66.2%）为吸烟者，88例（28.0%）为非吸烟者。就疾病分期而言，125 例（39.8%）患者归类为 IA-IIB 期，154 例（49.0%）患者归类为 IIIA-IV 期。

为了全面研究 SCLC 的内在和外在改变，他们对 39 例患者的 65 个样本（39 个肿瘤、14 个邻近正常肺组织、7 个外周血单核细胞和 5 个淋巴结）进行了 scRNA-seq（图1a），对 45 对肿瘤-正常组织进行了转录组分析(RNA-seq)，对 53 对肿瘤-正常组织进行了 16S rRNA-seq 以评估微生物群落，对 111 对肿瘤-正常组织进行了全外显子组测序（WES），对 12 个福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 样本进行了单细胞空间蛋白质组学分析，对 62 例 SCLC 患者和 56 例健康供体的血清进行了细胞因子/趋化因子谱分析，并对一组独立的 136 例 SCLC 肿瘤进行了等位基因特异性剪接（ASE）分析。

为了确定小细胞肺癌（SCLC）中的主要细胞群，本研究对患者的样本进行了单细胞转录组分析（scRNA-seq）。从27例未经治疗的患者和12例接受治疗的患者中获得了432959个单细胞。通过选择各细胞谱系中的标记基因，鉴定出7种主要细胞类型和58种亚型（图1b-c）。主要细胞类型包括内皮细胞、成纤维细胞/成纤维细胞样细胞、I/II型肺泡细胞（AT1/2）/基底细胞/纤毛细胞/棒状细胞、神经内分泌细胞（NE）/癌细胞、巨噬细胞（Mφ）/单核细胞、B细胞和T/NK细胞（图1c）。如前所述，9个NE细胞聚类是SCLC癌细胞的代表。在27例治疗前肿瘤中，19例（70.4%）肺癌肿瘤的免疫细胞数量较少（<10%），7例（25.9%）肺癌肿瘤的免疫细胞数量中等（10-50%），1例（3.7%）肺癌肿瘤的免疫细胞数量较多（>50%）（图1d），提示不同患者的免疫微环境存在异质性。在血液样本中也检测到了癌细胞，这与之前的报道一致。与正常肺组织相比，肿瘤样本中AT2细胞和巨噬细胞数量较少，而癌细胞数量则有所增加。在治疗前和治疗后的肿瘤样本中，III期和IV期小细胞肺癌（SCLC）样本中的B细胞数量均显著低于I期和II期SCLC样本。在接受化疗或化疗联合免疫疗法（依托泊苷/顺铂联合抗PD-L1抗体）治疗的12例患者中，分别有4例、4例、3例和1例患者达到完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、疾病稳定（SD）和疾病进展（PD）。他们比较了缓解组和无缓解组的细胞组成，观察到缓解组中巨噬细胞、基底细胞和纤毛细胞的比例显著高于无缓解组，而癌细胞的比例显著低于无缓解组。

为了检验SCLC和非小细胞肺癌（NSCLC）免疫浸润的潜在差异，他们比较了该队列中SCLC肿瘤样本与中国人群NSCLC样本中免疫细胞的比例。与NSCLC样本相比，治疗前SCLC样本中T/NK细胞、B细胞和Mφ细胞的比例略低，但差异无统计学意义；而治疗后SCLC样本中B细胞的比例略高于NSCLC样本（图1e）。对不同数据集的RNA-seq数据进行反卷积分析显示，SCLC和NSCLC患者的T细胞、B细胞或Mφ细胞水平无显著差异（图1f）。

为了进一步阐明小细胞肺癌（SCLC）肿瘤样本中SCLC细胞和免疫细胞的空间分布，他们进行了单细胞分辨率的空间蛋白质组学分析。他们发现，肿瘤组织中浸润的免疫细胞数量少于正常肺组织，且早期SCLC患者的肿瘤中颗粒酶B+/CD8+ T细胞数量多于晚期SCLC患者。治疗后，CR和PR患者的这些免疫细胞数量高于SD患者。此外，他们在肿瘤中检测到了三级淋巴结构（TLS），发现早期患者的TLS数量多于晚期患者和治疗无应答患者（图1g-h）。这些 TLS 对 CD45、CD8、CD3、CD4 和 CD20 呈阳性，但对CD14呈弱阳性（图1g）。

他们研究了SCLC患者复杂微环境中存在的免疫细胞亚型，鉴定了7种不同的Mφ亚型、2种单核细胞亚型和1种树突状细胞（DC）聚类（图2a-b）。Mφ亚型因样本类型、肿瘤分期和新辅助治疗方案而异。具体而言，Mφ- IFI27（干扰素α诱导蛋白27）和Mφ- MSR1（巨噬细胞清道夫受体1）主要在正常邻近组织样本中发现，而大多数单核细胞则在外周血单核细胞（PBMC）样本中检测到（图2a）。新辅助治疗后，Mφ- S100A12（S100钙结合蛋白A12）、Mono- VCAN（Versican）和Mφ- SPP1水平降低，而Mφ- MSR1水平升高（图2c）。在未接受治疗的人群中，吸烟者的Mφ- MKI67（增殖标志物Ki-67）水平显著高于非吸烟者（图2d）。此外，达到部分缓解/完全缓解（PR/CR）的患者中Mφ- IFI27和Mφ- CSF1（克隆刺激因子1）水平升高，而Mφ- SPP1水平低于疾病稳定/进展（SD/PD）患者（图2e）。Mφ- SPP1与血管生成和肿瘤进展相关，他们通过分析其转录组特征对其进行了进一步表征。在 Mφ- SPP1中，参与受体介导的内吞作用和趋化因子反应的基因，如APOE、甘露糖受体 C 型1 (MRC1) 和CXC 基序趋化因子配体 8 (CXCL8)，均显著上调。

他们鉴定出14种不同的T/NK细胞亚群，包括幼稚T细胞（Tn细胞），其表达TCF7（转录因子7）、CCR7（CC基序趋化因子受体7）和LEF1（淋巴增强因子结合因子1）；中央记忆T细胞（Tcm细胞），其表达GZMK（颗粒酶K）和LMNA（层粘蛋白A/C）；效应T细胞（Teff细胞），其表达GNLY（颗粒溶素）；效应记忆T细胞（Tem细胞），其表达GZMK；耗竭CD4 +和CD8 + Tex细胞，其表达CXCL13（CXC基序趋化因子配体13）；调节性T细胞（Treg细胞），其表达FOXP3（叉头框蛋白P3）；NK细胞，其表达GNLY、KLRD1（杀伤细胞凝集素样受体D1）和IFI6（干扰素α诱导蛋白6）（图2f）。在该队列的肿瘤样本中，他们鉴定出 84 个NK细胞，占总 T/NK 细胞的 0.52%，占所有肿瘤细胞的 0.03%。此外，对3例未经治疗的SCLC患者的 FFPE 样本进行免疫组织化学(IHC) 分析显示，在 973346 个肿瘤细胞中，有3548个(0.36%)细胞 CD94（一种 NK 细胞标志物）呈阳性。新辅助治疗后，CD8_Tem -GZMK和 NK- KLRD1水平升高，而 CD4_Treg- FOXP3水平降低（图2g）。

他们鉴定了 9 个不同的 B 细胞亚群，包括幼稚 B (Bn) 细胞 Bn- TCL1A（TCL1 家族 AKT 共激活因子 A）、记忆 B (Bmem) 细胞类型 Bmem- NR4A2（核受体亚家族 4 A 组成员 2）和 Bmem- MKI67、滤泡 B (Bfoc) 亚型 Bfoc- NEIL1（Nei 样 DNA 糖基化酶 1）、Bfoc- LGALS3（半乳糖凝集素 3）和 Bfoc- MKI67，以及浆细胞亚型 pB- IGHA2（免疫球蛋白重链恒定区 α 2）、pB- IGHG2（免疫球蛋白重链恒定区 γ 2）和 pB- IGHGP（免疫球蛋白重链恒定区 γ P）（图2h）。新辅助治疗后，pB- IGHA2、Bmem- MKI67和 Bfoc- LGALS3的水平升高，其中达到PR或CR的患者pB- IGHA2水平更高（图2i）。这些结果提示 B 细胞可能在SCLC中发挥抗肿瘤作用，这与其在肺腺癌中的作用一致。

为了阐明癌细胞的复杂特征，他们分析了肿瘤样本中的非造血细胞，并鉴定了 19 个细胞聚类，其中包括 5 个非癌性细胞聚类：AT1、AT2、基底细胞、纤毛细胞和棒状细胞（图3a-b）。共获得 190313个癌细胞，并将其分为 14 个亚聚类：C0：SCLC-A-MKI67，C1：SCLC-A- CRIP2（富含半胱氨酸蛋白 2），C3：SCLC-A-CHGA（嗜铬粒蛋白 A），C4：SCLC-N- COL1A2（I 型胶原蛋白 α2 链），C6：SCLC-A- SPP1，C8：SCLC-A- RYR2（兰尼碱受体 2），C9：SCLC-Y- YAP1，C10：SCLC-N- CDKN3（细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 3），C12：SCLC-A- DLX5（远端缺失同源框 5），C13：SCLC-N- NNAT（神经蛋白），C14：SCLC-N- ALDOA（醛缩酶，果糖二磷酸 A），C16：SCLC-A- CALCA（降钙素相关多肽 α），C17：SCLC-A- YBX2（Y-Box 结合蛋白 2），以及 C18：SCLC-干细胞样细胞（SLC）（图3b-c）。

C1 和 C0 细胞聚类的数量分别达到 100754 个（占所有癌细胞的 52.94%）和 40807 个（占 21.44%），代表了两种最主要的癌细胞群。患者中 C1 和 C0 细胞聚类的中位比例分别为 65.52%（0–100%）和 18.59%（0–53.78%）（图3d）。44 号患者在接受化疗免疫治疗后达到完全缓解，治疗后未检测到癌细胞。此外，大多数肿瘤样本包含多个癌细胞聚类，在 39 个样本中的 28 个（71.79%）中检测到了 SCLC-A 和 SCLC-N 细胞群（图3e）。肝细胞核因子4α (HNF4A)是神经内分泌癌，尤其是胃肠道神经内分泌癌的一个新兴标志物。然而，HNF4A在癌细胞中的表达相对较低。此外，与正常上皮细胞相比，癌细胞聚类表现出更高的拷贝数变异（CNV）负荷，这与恶性表型相符。

C18聚类表达与干细胞和癌症起始细胞特征相关的基因，包括活化白细胞黏附分子(ALCAM)/CD166、Musashi 2 (MSI2)、SRY-box 转录因子2 (SOX2)、SOX1、胰岛素样生长因子结合蛋白 5 (IGFBP5)、L-Myc (MYCL)、prominin-1 (PROM1)/CD133、转录因子3(TCF3)以及神经内分泌标志物嗜铬粒蛋白A(CHGA)（图3c）。基因集富集分析 (GSEA) 显示，与其他类型的癌细胞相比，SLC显著富集 MYC 靶基因和 WNT-β-catenin 通路基因（图3f）。这些结果为进一步的功能研究提供了证据，以验证所鉴定通路的生物学意义。与其他细胞聚类相比，SLC的多能性评分最高（图3g）。SLC 包含 1771 个细胞，占每位患者所有癌细胞的 0% 至 25.78%。在一例确诊三天后死亡的 IV 期患者（#P26）中，SLC 占 2207 个癌细胞中的 569 个（25.78%）。在两例接受新辅助治疗的患者中，SLC 占治疗后肿瘤样本的 10% 以上。在39例患者中，27例（69.2%）检测到SLC，其中SCLC-A亚型23例，SCLC-N亚型3例，SCLC-Y亚型1例。28例男性患者中有16例（57.1%）SLC阳性，11例女性患者中有11例（100%）SLC阳性；22例吸烟者中有12例（54.5%）SLC阳性，17例非吸烟者中有15例（88.2%）SLC阳性。

他们采用“加权最近邻”方法对上皮细胞的身份基因标记进行了富集分析，发现除SCLC- YAP1细胞外，几乎所有癌细胞均表现出神经内分泌富集评分（图3h）。此外，SCLC-A和SCLC-Y细胞的聚类1、13、17、8和4呈现出中等至强的棒状细胞和弱的基底细胞评分（图3h），提示SCLC可能具有不同的起源。然而，研究表明，在肺发育过程中，Notch信号通路通过阻断前体细胞分化为神经内分泌细胞，并通过RE1沉默转录因子（REST）和YAP1促进神经内分泌细胞向棒状细胞转化，从而诱导神经内分泌向非神经内分泌的转换。因此，这些结果提示SCLC可能仍然起源于共同的祖细胞。

他们分析了不同疾病阶段的SCLC细胞聚类，发现SCLC-A- MKI67和SCLC-A -CRIP2细胞聚类在I-II期和III-IV期均较高，且在新辅助治疗后显著降低，同时AT2细胞显著增加。在治疗前样本中，SCLC-A- MKI67细胞聚类占每位患者所有癌细胞的20.93%；在治疗后样本中，该细胞聚类消失（图3i），证实了初始治疗的临床疗效。SCLC-A- CRIP2细胞聚类在治疗前样本中占所有癌细胞的69.08%（范围：0%–96.82%），在治疗后样本中占所有癌细胞的33.33%（范围：0%–100%）（图3i），提示其可能在耐药性和复发中发挥作用。在新辅助治疗后，达到 PR/CR 的患者中 SCLC-A-MKI67细胞的比例低于达到 SD/PD 的患者，并且 PR/CR 组中非癌细胞的比例高于 SD/PD 组（图3j）。

他们分析了SCLC中的抗原加工和呈递（APP）通路，发现大多数癌细胞中通过主要组织相容性复合体I类（MHC-I）和MHC-II的APP表达显著受到抑制（图4a），这与之前的报道一致。他们分析了每个细胞聚类中的MHC-I评分，结果显示，HLA-A、HLA-B和HLA-C在癌细胞聚类13、0、9、1、6和18中的表达较低；在聚类14、4和10中的表达中等；在聚类8、17、3、12和16中的表达较高（图4b），表明SCLC细胞群体中MHC-I的表达存在异质性。MHC-I高表达聚类的总数为19191个，占所有SCLC癌细胞的10.08%。为了验证上述发现，他们分析了空间蛋白质组学数据，发现一部分EPCAM+癌细胞也表达HLA-A（图4c），中位比例为5.79%（图4d）。一部分EPCAM+癌细胞表达HLA-DRA（图4e），中位比例为10.28%（图4d）。然而，EPCAM+KI67+细胞HLA-A和HLA-DRA均为阴性（图4f）。他们通过SCLC蛋白质组学数据分析了MHC组分与MHC-I低表达或高表达细胞聚类的标志基因之间的潜在关联，发现MKI67的表达水平与MHC-I和MHC-II分子的表达水平呈负相关（图4g）。因此，SCLC细胞聚类中MHC表达的异质性以及MKI67在MHC-I和MHC-II调控中的作用值得进一步研究。

几乎所有癌细胞聚类中MHC-II分子的表达均较低（图4b）。MHC-II分子，特别是HLA-DQB1，在几乎所有T/NK细胞聚类中表达均较低，而HLA-DRA和HLA-DRB1在T/NK细胞聚类1和8中表达较低。HLA-DRA、DRB1和DQB1在巨噬细胞/单核细胞聚类1中也表达较低（图4b）。通过CellChat方法进行的细胞间相互作用分析显示，在39例患者中，癌细胞与T/NK细胞/巨噬细胞之间通过MHC-I和MHC-II的相互作用概率较低。单细胞空间蛋白质组学分析显示，早期SCLC患者肿瘤组织中HLA-A和HLA-DR的表达水平均高于晚期SCLC患者（图4h-i）。治疗前癌细胞中HLA-A/HLA-DR表达水平较高的患者对新辅助治疗的反应更好，且治疗有效者的HLA-A/HLA-DR表达水平高于治疗无效者（图4h-j）。位于肿瘤中心的癌细胞HLA-A染色较弱，而位于肿瘤边缘的癌细胞染色较强，且周围环绕着免疫细胞（图4k）。

他们使用STAR-Fusion 52和FusionInspector工具检测融合基因，排除正常样本中发现的融合基因，最终获得32个候选融合基因。其中9个（ARID1B-ZDHHC14、CSNK1D-CCDC57、CTNNBIP1-CLSTN1、DNER-PID1、EIF4G3-ECE1、MED20-USP49、PSMB7-NR6A1、TIRAP-DCPS和TPD52L2-DNAJC5）已在之前的研究中报道过。其余23个融合基因包含完整的启动子和终止子，可用于蛋白质翻译。利用 RT-PCR 和可用的肿瘤样本，他们验证了ARID1B-ZDHHC14和CSNK1D-CCDC57，表明它们具有潜在的生物学相关性，值得进一步研究。

为了进一步阐明SCLC的内在改变，他们利用RNA-seq数据分析了ASE，鉴定出存在于肿瘤组织而非正常肺组织中的剪接变异。在45个SCLC样本中，18268个基因表现出ASE，其中3092个具有显著性。这些事件包括跳跃外显子（SE）、5'端可变剪接位点（A5SS）、3'端可变剪接位点（A3SS）、互斥外显子（MEE）和内含子保留（RI）。最常见的ASE是SE，在18268个受影响的基因中，有18029个（98.7%）基因存在SE。在45例患者中，分别有1971、1024、267、219和409个显著基因与SE、MEE、A3SS、A5SS和RI相关。

包括CD47、CLSTN1、DLG1、EEF1D和FAK/PTK2在内的16个基因（图5a）在所有 45 例患者中均表现出ASE（图 5a）。选择FAK剪接变体进行进一步研究，是因为这些变体在非小细胞肺癌 (NSCLC) 中出现频率相对较低，但在小细胞肺癌 (SCLC) 中未见报道。此外，FAK 抑制剂对 SCLC 细胞具有抑制作用，并且在 I 期临床试验中，接受 PF562271 治疗的 1 例患者均实现了病情稳定。在 SCLC 中，编码自磷酸化位点 Y397 的密码子两侧分别插入了两个额外的剪接盒，长度分别为 18 bp（盒 6）和 21 bp（盒 7），分别命名为FAK 6、FAK7和FAK6,7（图5b）。在 FAK 6中，插入了六个氨基酸，原有的 Y397 残基变为 Y403；在 FAK 7和 FAK 6,7中，分别在 Y397 之后插入了一个额外的酪氨酸残基 Y414 或 Y420（图5b）。肿瘤组织中含有 Box 6 和 Box 7 的FAK转录本的剪接百分比 (PSI) 值远高于正常肺组织中的值（图5c）。在本队列中，合并 SCLC 患者的样本量较小，且合并 SCLC 患者的 FAK 6/7水平似乎与 SCLC 患者相当。然而，当纳入其他队列的RNA-seq 数据后，他们发现纯 SCLC 患者中检测到的 FAK 剪接变体数量多于合并 SCLC 患者。

为了评估这些ASE对FAK功能的潜在影响，他们使用AlphaFold2预测了FAK的结构。野生型（WT）FAK结构。与相应的晶体结构相比，FERM结构域和激酶结构域的Cα均方根偏差（RMSD）值分别为1.046 Å和0.983 Å。预测的FAK结构呈现自抑制构象（图5d），这与之前的报道一致。在该构象中，位于连接区并夹在FERM结构域和激酶结构域之间的Y397远离激酶结构域的激活环（A环）（图5d）。在FAK6中，Box 6的插入发生在Y403的N端，远离激酶结构域，提示其对自身磷酸化的影响可能很小（图5e）。在FAK7和FAK6,7中，Box 7的插入增加了Y397 C端环的长度，使其具有更大的构象自由度，并可能促进FAK7中Y397和FAK6,7中Y403的自身磷酸化（图5f-g）。此外，FAK7和FAK6,7中额外的酪氨酸残基可能作为额外的磷酸化位点（图5f-g），从而增强激酶活性，并可能在SCLC的发生发展中发挥重要作用。

他们在另外 109 例SCLC样本中验证了FAK变体，利用 RT-PCR 和后续的 Sanger 测序，他们对 37 例肿瘤-正常配对患者组织样本进行了分析），发现正常肺组织中仅检测到野生型FAK（图5h）。在 37 例肿瘤样本中，6 例 (16.2%) 仅显示FAK条带，4 例 (10.8% )显示两条条带（FAK和FAK6或FAK7），27 例 (73%) 显示三条条带（FAK、FAK6 / FAK7和FAK6,7）（图5h）。

在正常对照组织中，未检测到FAK的替代剪接（图5h），这促使他们通过RT-PCR分析进一步研究福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本中的FAK剪接变体。他们发现，27例（27.3%）、10例（10.1%）和62例（63.6%）患者分别携带FAK+、FAK6 /FAK 7和FAK 6,7（图6a）。

为了可视化FAK剪接变体的单个 RNA 分子，他们对 56 个 FFPE 样本进行了 BaseScope 双重检测，这些样本已使用针对 Box 6 和 Box 7 的探针通过 RT-PCR 进行了检测。在 13 个 RT-PCR 检测FAK呈阳性的样本中，未检测到 Box 6 或 Box 7 信号；在 5 个FAK6 / FAK 7样本中，检测到了 Box 6（蓝色）和 Box 7（红色）信号；在 35 个FAK6,7样本中，检测到了 Box 6（蓝色）和 Box 7（红色）信号，以及FAK6,7（重叠信号）（图6b）。

为了确定 FAK ASE 是否在特定的 SCLC 亚型中富集，他们分析了FAK剪接变异体与四种潜在 SCLC 亚型之间的潜在关联。在 68 例ASCL1+ SCLC 中，65 例(95.6%) 存在FAK变异体；在 50 例NEUROD1+SCLC 中，45 例 (90%) 存在 FAK 变异体；在 12 例POU2F3+SCLC 中，6 例 (50%) 存在 FAK 变异体；在 24 例YAP + SCLC中，3 例 (12.5%) 存在FAK 变异体（图6c），表明 FAK 剪接变异体主要与ASCL1+和NEUROD1+SCLC 亚型相关。

他们使用针对磷酸化Y397（存在于FAK和FAK7中）或Y403（存在于FAK6和FAK6,7中）的抗体，通过IHC检测了FFPE样本中磷酸化FAK（p-FAK）的表达。结果显示，FAK6 /FAK7患者的p-FAK水平高于FAK单突变患者，而FAK6,7患者的p-FAK染色水平最高（图6d）。与此一致的是，FAK6,7患者的免疫反应评分（IRS）最高（中位数为12），其次是FAK6 /FAK7患者（中位数为9），最后是FAK单突变患者（图6e）。在这些患者中，p-FAK主要定位于细胞质，但也观察到核内p-FAK，尤其是在FAK6,7和FAK6/FAK7双阳性患者中（图6d）。Western blot分析证实，FAK6,7双阳性患者的p-FAK表达水平高于FAK单阳性患者（图6f）。

为了验证携带 FAK 剪接变体的患者中核内 p-FAK 表达增加，他们对SCLC细胞系进行了亚细胞分级分离分析。结果发现，与表达 FAK 的 H1339 和 DMS114 细胞相比，表达 FAK6,7 的 H524 和 H82 细胞系中核内 p-FAK 表达增加（图6g）。此外，与转染 FAK 的细胞相比，瞬时转染FAK7和FAK6,7 的DMS114 细胞中也检测到了核内 p-FAK 表达增加（图6h）。鉴于核内FAK能够调节趋化因子CCL5、CCL10、CCL1、CCL7和CXCL13、白细胞介素6 (IL6)、IL33、凋亡调节因子BCL2以及原癌基因MYC和MDM2的表达，他们检测了FAK变体对这些基因在野生型FAK阳性的DMS114和H1339细胞中的潜在影响，这些细胞已转染了FAK或FAK转录本。通过qPCR，他们发现FAK和FAK6,7均能上调这些基因的表达；在这些细胞中，FAK6,7对CCL7、CXCL13和BCL2的影响显著大于FAK（图6i）。

他们分析了FAK变异与可获得生存信息的患者预后之间的潜在关联，其中包括24例FAK-/-患者、10例FAK6/FAK7患者和60例FAK6,7患者。与携带FAK剪接变异的患者相比，携带FAK剪接变异的SCLC患者的预后显著更差（图7a），提示FAK可变剪接变异可能在SCLC的发病机制中发挥关键作用。

由于这些细胞系已建立数十年且存在明显的局限性，他们检测了PF562271对患者来源类器官（PDO）和患者来源异种移植（PDX）模型的影响。利用随机获得的样本建立了三个SCLC PDO，其中两个携带FAK6,7突变（图7c）。PF562271对FAK6,7突变PDO的生长有轻微抑制作用，但对FAK6,7突变PDO的生长有显著抑制作用（图7c）。他们测试了PF562271对携带FAK6,7突变PDX模型的影响（图7d）。在PDX模型1中，该模型来源于一名携带FAK 6,7突变以及TP53和Rb1基因突变的男性患者，相对低剂量（50 mg/kg）的PF562271可显著抑制肿瘤生长达73.5%（图7d-e），并使肿瘤重量减轻75%（图7f）。IHC分析显示，PF562271显著下调了p-FAK和Ki67的表达（图7g-h）。通过对肿瘤样本裂解液进行Western blot分析，证实了PF562271治疗小鼠中p-FAK的下调（图7i）。在源自FAK6,7突变、TP53和Rb1突变女性患者的PDX模型2中，PF562271显著抑制了肿瘤生长（图7j-k），降低了肿瘤重量（图7l），并抑制了p-FAK和Ki67的表达（图7m-o）。此外，在H82异种移植小鼠模型中，50 mg/kg/天剂量的PF562271抑制了肿瘤生长，而150 mg/kg/天的剂量则有效抑制了肿瘤生长，并显著降低了p-FAK和Ki67的水平（图7p-u）。

为了研究肠道菌群在SCLC中的潜在作用，他们对53例患者的肿瘤邻近正常肺组织配对样本进行了16S rRNA基因测序。结果显示，肿瘤组织和正常肺组织中细菌DNA的比例、肠道菌群α多样性指数以及整体肠道菌群组成均无显著差异。在肿瘤组织和正常组织中，变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门均为优势菌门，而乳杆菌属、不动杆菌属和甲基杆菌属则是优势菌属。此外，肿瘤组织微生物群的差异与肿瘤分期或吸烟状况。

在111例患者中，TP53和RB1分别在78例（70.3%）和53例（47.7%）中发生突变（图8a）。WES和RNA-seq数据显示，在Rb1野生型肿瘤（n = 18）中，Cyclin D1、Cyclin D2和Cyclin D3的表达略高于Rb1突变型肿瘤。在TP53野生型肿瘤（n = 10）和TP53突变型肿瘤中，Cyclin D1、Cyclin D2和Cyclin D3的表达无显著差异。这些结果表明，SCLCp53 和 Rb1 通路可能存在其他改变，值得进一步研究。

核苷酸变化分析显示，C:G→A:T颠换和C:G→T:A转换是最常见的核苷酸替换，吸烟者的替换率高于非吸烟者（图8b）。在吸烟者中，C:G→T:A转换的平均数量（每Mb 6.71个）高于C:G→A:T颠换的平均数量（每Mb 5.95个）。此外，这些患者的平均C:G→G:C颠换（烟草致癌物1,3-丁二烯的特征突变）和平均T:A→A:T颠换（空气污染物氯乙烯的特征突变）也较高（图8b-c）。T:A→C:G 转换通常由烟草致癌物 N-亚硝基二乙胺和一种广泛使用的合成工业化学品 1,4-二恶烷诱导，导致吸烟者中每兆碱基发生 3.11 个突变，非吸烟者中每兆碱基发生 1.83 个突变。他们分析了每位患者中每个突变碱基的 5' 和/或 3' 序列环境中的核苷酸替换，发现特征 4（多环芳烃暴露的特征）在吸烟者和非吸烟者中均是最常见的特征。特征 5、24、39 和 87 在这些患者中也相对较高。

利用非负矩阵分解算法和突变模式数据，他们获得了四种新的突变特征A、B、C和D（图8d），这些特征与各种内在或外在因素相关的特征相似。特征A主要由C>T突变和极少的C>A颠换组成。特征B的特征是突变分布于所有96种碱基替换亚型中，其中C>T、C>G和T>A突变的水平相对较高。特征C表现出较高比例的C>T和T>C突变，而特征D的特征是除其他5种突变类型外，还存在C>A替换（图8d）。根据这些新发现的特征，将111 名患者分为四组：第 1 组（12 名患者，10.8%）的特征是特征 A，第 2 组（10 名患者，9%）的特征是特征 B，第 3 组（38 名患者，32.2%）的特征是特征 C，第 4 组（51 名患者，45.9%）的特征是特征 D（图8c）。他们根据选定环境因素的突变特征以及暴露于烟草相关化合物（如苯并[a]芘-7,8-二氢二醇-9,10-环氧化物 (BPDE)/BaP、二苯并[a,j]吖啶 (DBAC)、甲基丁香酚、二苯并[a,h]蒽 (DBA) 和甲醛）的证据，分析了这些患者基因组中的核苷酸替换情况。对突变谱及其基因组体细胞突变比例的分析显示，吸烟者和非吸烟者之间的环境特征相似，提示非吸烟者可能暴露于二手烟和空气污染物。

本研究通过对314例SCLC样本进行多组学分析，发现ASCL1+ / MKI67+和ASCL1+/ CRIP2+细胞聚类占39例患者共190313个SCLC癌细胞的74.38%，而ASCL1+SOX1+干细胞样细胞聚类则存在于所有SCLC亚型中。MHCI类分子在6个癌细胞聚类中低表达，在5个癌细胞聚类中高表达，且MHC I类分子的表达水平与KI67的表达水平呈负相关。mRNA异常剪接是SCLC的特征之一，在154例患者中，119例（77.3%）检测到FAK剪接变异。FAK变异表现出激酶活性升高，预后最差，并且在患者来源的类器官和异种移植模型中对FAK抑制剂敏感。除TP53和RB1外，还发现了11种高频突变，吸烟状况和肿瘤分期不影响SCLC患者的肠道菌群变异。综上所述，本研究的数据进一步揭示了复杂的肿瘤内异质性，并发现FAK剪接变异代表了SCLC癌基因的高频功能获得性改变，是这种难治性癌症的潜在治疗靶点。