文献解读|Cancer Genetics（11.0）：移植相关皮肤鳞状细胞癌中 Pre-Tem CD8+ T 细胞的 EOMES 相关分化程序异常

实体器官移植受者需要长期接受免疫抑制治疗以维持移植物耐受，但由此带来的肿瘤风险也显著升高。移植相关皮肤鳞状细胞癌（TSCC）是其中较常见且侵袭性较强的肿瘤类型。既往研究多将这一现象归因于免疫监视减弱或 CD8+ T 细胞数量下降，但肿瘤内残存 CD8+ T 细胞是否还能完成从前体状态到杀伤效应状态的分化，仍缺乏系统解释。

前体效应记忆 CD8+ T 细胞（Pre-Tem）兼具前体和效应记忆特征，理论上可继续生成下游效应细胞，因此其积累本身并不等同于免疫功能增强。本文整合单细胞转录组、T 细胞受体（TCR）克隆谱、调控网络和空间转录组数据，比较 TSCC 与免疫功能完整人群皮肤鳞状细胞癌（SCC）中的 CD8+ T 细胞状态，重点追问长期免疫抑制是否使 Pre-Tem 停留在早期状态，并解析其中与 EOMES 转录因子及 CXCL10-CXCR3 趋化信号轴相关的分化异常。

文章首先建立 TSCC 与常规 SCC 的 CD8+ T 细胞图谱，意在区分长期免疫抑制造成的是细胞“数量减少”，还是细胞“状态改变”。研究流程整合两类肿瘤的单细胞、TCR 与空间数据，为细胞状态、克隆扩增和组织定位提供多层证据（图1a）。在 22,590 个 CD8+ T 细胞中，降维可视化（UMAP）识别出 Pre-Tem、效应记忆 CD8+ T 细胞（Tem）、耗竭 CD8+ T 细胞（Tex）、终末效应记忆 CD8+ T 细胞（TEMRA）和初始/中央记忆 CD8+ T 细胞（Tn/Tcm）等主要状态，标志基因表达支持这一注释（图1b-c）。两组比较显示，TSCC 中最突出的变化是 Pre-Tem 比例升高，而更成熟的效应状态未同步增加（图1d-e）。这提示移植后肿瘤中的 CD8+ T 细胞并非完全缺失，而可能停留在难以继续分化的前体阶段。进一步聚焦 Pre-Tem，TSCC 来源细胞下调 GZMK、EOMES、CD27、NKG7 和 CCL4 等活化或细胞毒相关基因，同时上调 DDIT4、IFITM3 等应激基因（图1f）。调控网络显示，EOMES、TBX21 和 BHLHE40 等效应分化相关调控子在 TSCC 中整体减弱（图1g）；功能评分也显示其早期活化、细胞毒和记忆程序降低，而糖皮质激素代谢与衰老相关分泌表型升高（图1h）。

在发现 Pre-Tem 富集后，研究团队进一步追问这些细胞是正常分化的暂时中间态，还是被免疫抑制“卡住”的群体。拟时序分析将 CD8+ T 细胞排列为一条连续轨迹：Tn/Tcm 经 Pre-Tem 进入分叉点后，可沿 Tem 向 Tex 方向发展，也可经 Tem 走向 TEMRA 状态（图2a-b）。按疾病来源着色后，TSCC 细胞更多聚集在分叉前的早期轨迹，而 SCC 细胞广泛分布于后续成熟阶段（图2c）；分段统计也显示，TSCC 在早期区间的 Pre-Tem 占比更高，终末分化区间的细胞相对不足（图2d）。这让图1的比例变化具备了时间维度上的解释，即 Pre-Tem 积累可能对应成熟输出不足。TCR 克隆分析进一步支持这一判断：与 SCC 相比，TSCC 中 Pre-Tem、Tem 和 Tex 的大克隆比例整体下降，提示抗原驱动后的有效扩增受限（图2e）。将克隆大小投射到拟时序轨迹后，SCC 的扩增克隆可延伸至 Tex 和 TEMRA 等较晚状态；TSCC 的扩增克隆则主要局限在前体相关区域，且多为小、中等克隆（图2f）。按亚群统计，大克隆在 SCC 中可见于多个分化阶段，而 TSCC 的大克隆更偏向 Pre-Tem（图2g）。最后，作者展示前 10 个克隆在 UMAP 与拟时序空间中的位置，并将黏膜相关不变 T 细胞（MAIT）克隆作为不进入后续 CD8+ T 细胞分析的参照（图2h-i）。

为定位阻碍分化的调控节点，研究团队沿拟时序轨迹观察基因动态。常规 SCC 中，EOMES 在分叉后保持较高水平并继续增强，TBX21 也随之上调，同时伴随 GNLY、GZMB、TOX 和 PDCD1 等效应或耗竭相关基因的诱导；但在 TSCC 中，EOMES 在分叉后逐渐下降，TBX21 的上调也明显减弱（图3a）。EOMES 因而从图1中下降的差异基因和调控子，成为连接前体与下游效应状态的候选节点。作者比较扩增与未扩增的 Pre-Tem 后发现，扩增细胞更高表达 T 细胞活化、细胞毒相关基因，并呈现突出的 EOMES 表达（图3b）。以扩增 Pre-Tem 上调基因构建蛋白互作网络后，EOMES 位于网络中心，提示其可能协调多个效应模块（图3c）。将疾病来源和克隆扩增状态交叉分层后，SCC 扩增 Pre-Tem 的 EOMES 调控子活性最强，而 TSCC 中这一程序即使在扩增细胞内也受到压低（图3d）。CellOracle 虚拟扰动进一步预测，降低 EOMES 会下调 NKG7、CCL4、CRTAM、GZMK 和 LYST 等细胞毒/效应相关基因；提高 EOMES 则产生相反方向的预测变化（图3e）。这些预测靶基因中，多数也正是 TSCC Pre-Tem 相较 SCC 下调的基因（图3f）。

为避免结论只来自 TSCC 与 SCC 的横向比较，研究团队转而分析配对 SCC 肿瘤-邻近组织队列 GSE144236，检验 EOMES 程序是否也是常规抗肿瘤免疫的一部分。该队列包含 10 位患者的肿瘤与匹配正常皮肤，从 1,761 个 T/NK 细胞中识别出 8 个主要亚群（图4a）。Pre-Tem 在肿瘤组织中占 17.1%，在邻近组织中仅占 5.4%，说明这一状态会进入肿瘤免疫生态，而非移植患者特有的现象（图4b）。标志基因图将肿瘤内 Pre-Tem 定义为 TCF7+EOMES+ 群体，并与 PDCD1+LAG3+ 的 Tex 区分开来（图4c）。与邻近组织来源 Pre-Tem 相比，肿瘤内 Pre-Tem 更高表达 EOMES 及多种相关效应基因（图4d），提示在免疫功能相对完整的 SCC 中，这类前体细胞伴随更活跃的效应分化程序。拟时序结果将 Pre-Tem 与 Tex 连接为连续状态，邻近组织细胞偏向早期，而肿瘤细胞主要分布在由 Pre-Tem 向下游状态推进的路径上（图4e-f）。沿轨迹观察，EOMES 逐步升高，TCF7 随之下降，GZMB 与 PDCD1 增加，显示前体特征、细胞毒功能与耗竭标志可以在同一分化连续体中先后出现（图4g）。调控子活性热图也显示，EOMES 程序主要富集在肿瘤浸润的 Pre-Tem 中（图4h）。

在确定 EOMES 程序与 Pre-Tem 分化相连后，作者进一步寻找可能塑造这一状态的微环境信号。CellChat 分析显示，Pre-Tem 在肿瘤内接收来自肿瘤角质形成细胞和肿瘤相关巨噬细胞的广泛输入；比较正常与肿瘤组织后，CXCL 类信号是肿瘤中最突出的增强通路之一（图5a）。网络图将这种变化具体化：肿瘤内不同细胞群之间的 CXCL 通讯更活跃，Pre-Tem 处于重要受体位置（图5b）。配体-受体贡献分析锁定 CXCL10-CXCR3 为肿瘤条件下指向 Pre-Tem 的主要轴，而邻近组织更突出的是成纤维细胞经 CXCL12-CXCR4 传递的信号（图5c）。不同发送者-受体组合显示，CXCL10-CXCR3 在肿瘤环境中更倾向于连接肿瘤相关巨噬细胞、Pre-Tem 和 Treg（图5d）；表达谱也证实 CXCR3 主要位于 Pre-Tem 和 Treg，CXCL10 则主要由肿瘤相关巨噬细胞提供（图5e）。CellOracle 对 CXCR3 的虚拟扰动预测，升高 CXCR3 会压低 EOMES 及多项细胞毒/效应基因，而降低 CXCR3 则可能提高 EOMES 并恢复部分效应程序（图5f）。在关键基因层面，CXCR3 预测上调 PDCD1、LAG3、HAVCR2 等耗竭相关基因，预测下调 IL7R、RUNX3 等与 EOMES 网络相连的基因（图5g-h）。

最后，研究团队利用空间转录组将单细胞层面的“细胞状态”和“通讯轴”放回组织结构中验证。连续切片首先按肿瘤、基质和免疫模块划分空间区域，为后续定位提供组织学坐标（图6a）。Pre-Tem 特征评分在三张切片中均形成沿肿瘤-基质交界处分布的连续带状区域，而肿瘤核心内信号较弱（图6b）。定量距离分析显示，Pre-Tem 评分随与最近肿瘤区域距离的增加而升高，二者呈显著正相关，说明这类细胞更偏好停留在肿瘤边缘，而非深入肿瘤巢（图6c）。进一步区分 EOMES 状态后，EOMES+ Pre-Tem 比 EOMES- Pre-Tem 距肿瘤核心更远（图6d），且前者具有更高的 Tem 模块与 Pre-CD8+ T 细胞特征评分，而终末耗竭模块并无显著差别（图6e）。这与前文的拟时序结果相呼应：EOMES+ Pre-Tem 更像保留前体特征、同时开始获得效应记忆程序的中间状态。空间共定位分析显示，Pre-Tem 高评分区域与 CXCL10 高表达区域的实际最近邻距离显著小于随机置换预期，提示两者在组织中并非随机相遇（图6f）。在三张切片中，Pre-CD8+ T 细胞特征与 CXCL10 信号、CXCR3 轴活性均呈正向空间交叉相关（图6g）。

本文提出，TSCC 的抗肿瘤免疫障碍不应只理解为 CD8+ T 细胞数量不足，更重要的是 Pre-Tem 向成熟效应状态的转变受阻。多组学证据显示，TSCC 中 Pre-Tem 积累在早期分化轨迹、克隆扩增受限，并伴随 EOMES 相关调控程序和细胞毒功能下降。独立 SCC 队列进一步支持 EOMES 相关 Pre-Tem 程序与肿瘤内抗肿瘤 CD8+ T 细胞状态相联系。

文章同时提出，肿瘤相关巨噬细胞提供的 CXCL10-CXCR3 信号可能与这种分化偏移有关，且 Pre-Tem、CXCL10 信号和 EOMES 状态共同集中在肿瘤边缘。需要注意的是，EOMES 与 CXCR3 的功能均主要由网络推断、虚拟扰动和空间关联支持，当前工作建立的是具有生物学合理性的机制框架，而非直接因果证明。后续若能在更大 TSCC 队列中结合免疫抑制方案信息，并通过体内外功能实验验证 EOMES/CXCR3 的作用，将更有助于判断该轴能否成为移植相关肿瘤的干预靶点。