文献解读|Signal Transduct Target Ther（81.2）：对临床和新型双膦酸盐反应的多组学分析揭示了其对衰老相关特征的骨外影响 

多种衰老相关疾病可能具有共同的分子病因，其驱动因素包括细胞衰老、基因组不稳定、蛋白质稳态受损和线粒体功能障碍等基本特征。因此，针对这些核心机制的单一治疗干预措施可能同时提供针对多种疾病的广谱保护（衰老科学假说）。在过去的50年中，双膦酸盐（BP）类药物已在全球广泛用于治疗骨质流失过多的疾病（例如骨质疏松症、癌症引起的骨溶解）。从化学角度来看，BP是焦磷酸盐的稳定类似物，其中POP键由不可水解的PCP骨架所取代。这种看似简单的结构改变赋予了BP抵抗酶降解的能力以及独特的与钙化表面结合的能力，再加上其抑制骨吸收的能力，促使人们开发出多种不同的BP用于临床。近期临床证据表明，BP还具有骨骼外益处，但其作用机制尚不清楚。

全球范围内的一系列与骨质流失相关的随机对照试验表明，BP治疗与骨骼以外的致命事件较少相关，其中利塞膦酸钠（RIS）的测试次数最多（34.44 %），唑来膦酸（23.77%）显示出最大的显著益处，其次是伊班膦酸钠（IBN）（24.2%）和阿仑膦酸钠（ALN）（17.59%），这些结果主要针对各大洲的女性人群（图1a）。此外，对BP治疗研究（临床和临床前研究）进行了描述性总结。研究揭示了与多种器官和组织部位疾病预后改善相关的因素（图1b）。这些疾病包括心血管疾病（例如血管钙化、中风、动脉粥样硬化、心肌梗死）、癌症（例如食管癌、结直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、宫颈癌和卵巢癌）、糖尿病、神经退行性疾病、听力丧失、遗传性疾病[例如假性黄色瘤 (PXE)、早衰症]、寄生虫感染（恰加斯病、利什曼病）和风湿性疾病（强直性脊柱炎、类风湿性关节炎）。

从骨质疏松症女性患者中采集血浆样本，分别在接受唑来膦酸（5 mg，18个月和36个月）输注前后进行检测，以评估系统蛋白水平的变化（图2a）。唑来膦酸治疗18个月和36个月后，大量蛋白的循环水平发生显著改变（图2b-c）。其中，变化最显著的蛋白包括KLC1、FER、TMOD2、FYN、PPFIA1、CLINT1、SMTN、TANK、AMPD2和LTB4R。大量循环蛋白的改变与人类衰老基因组资源（HAGR）数据库中的衰老相关特征相关（图2d），包括基因组不稳定性、蛋白质稳态丧失、营养感知失调、线粒体功能障碍和干细胞耗竭的下调标志物（图2e）。

此外，一些下调蛋白鉴定为衰老细胞释放的毒性混合物[即衰老相关分泌表型（SASP）]的常见成员（包括炎症介质IL-6、NFκB和STAT3，以及衰老促进因子CDKN1A和CDKN2D），提示唑来膦酸可能对中老年女性具有衰老调节作用（图2f）。此外，GSEA 分析显示，ZOL 下调的蛋白质在与细胞衰老和大脑老化相关的基因集中显著富集（图2g）。

血浆蛋白质组的显著变化反映了女性骨质疏松患者血液系统中唑来膦酸引起的系统性改变，但仅凭这一点并不能揭示BP对单个器官的影响或BP诱导转录组变化的可能性。为了检测ZOL在骨骼以外的转录组影响，研究团队从老年（24月龄，雌性）小鼠中收集了8种非骨骼组织，这些小鼠在接受唑来膦酸治疗（2个月，125 μg/kg或载体对照）后，并比较了基因特征的局部变化。在每个组织中，他们使用免疫荧光染色（CD45、panCK）切片，基于关键的组织特异性区域，选择具有代表性的器官感兴趣区域（ROI），然后通过GeoMx平台进行转录组分析(RNA-seq)（图3a）。UMAP分析显示，老年小鼠的ROI样本表现出不同的器官特异性转录组谱（图3b）。与载体对照组相比，唑来膦酸治疗显著改变了肝脏和心脏组织的基因表达谱（图3c），这与在不同器官中观察到的差异基因表达模式一致（图3d）。同样，在女性患者中，显著改变的血浆蛋白在胃、心肌和骨骼肌、骨髓、大脑皮层、肝脏和睾丸中表现出最高的组织特异性，这与小鼠数据一致。

在肝脏中，唑来膦酸治疗后差异表达基因（DEG）主要上调，并参与过氧化物酶体β-氧化、解毒、能量平衡、氨基酸代谢和色氨酸代谢；而下调的基因则富集于与炎症衰老和复制应激相关的通路（图3f）。在心脏中，唑来膦酸诱导了控制脂肪酸β-氧化、线粒体能量产生、心肌细胞功能、蛋白质合成和氧化还原稳态的基因上调，而下调的基因则与血管重塑和应激反应相关（图3f）。在肠道中，ZOL治疗显著下调了脂质和胆固醇代谢通路，提示其可能抑制与年龄相关的血脂异常或代谢漂移。在肺部，DEG富集了脂蛋白转运和类固醇生物合成相关基因。在肝脏、心脏、脾脏和肠道中，共有53个DEG映射到HAGR数据库（图3e）。其中包括15个与有益过程相关的上调基因，例如脂肪酸β-氧化、过氧化物酶体生物合成、脂质解毒、细胞器质量控制、蛋白质稳态、线粒体电子传递和抗氧化（图3g）。有趣的是，细胞反卷积结果表明，年轻小鼠和老年小鼠的器官细胞分布存在显著差异。然而，在给予唑来膦酸后，老年小鼠的心脏、肝脏和肠道中的细胞分布向年轻小鼠的分布转变（图3h-j）。

BP通过与钙化表面（骨骼）结合并由破骨细胞内吞，其作用主要局限于这些细胞。然而，骨微环境（及其他）中的其他吞噬细胞群也可能具有内吞BP的潜力，并可能对骨骼以外的组织产生影响。他们已证实原位BP治疗后会产生系统性蛋白质组学和局部转录组学效应，因此他们试图验证并可视化BP在多种非骨骼人类细胞类型中的内吞作用。他们使用了荧光标记的利伐沙班（ROX-RIS）和唑来膦酸（FAM-ZOL、ATF-ZOL），以及基于病毒的荧光细胞器标记物。虽然不同细胞类型的摄取效率有所差异，但在大多数受试细胞中均观察到了RIS和唑来膦酸（图4a-b）（0.1 µM）。其中，心脏、肾脏和肝脏细胞的BP含量最高，表明BP的细胞内可用性可能因组织而异。利用一系列细胞内细胞器标记物进行共免疫荧光成像显示，RIS和ZOL优先定位于溶酶体和内体，提示BP可能在调控细胞内蛋白质的质量、数量和修饰方面发挥作用（图4c-f）。这些观察结果不仅强调了BP比先前报道的更广泛的细胞可及性，而且暗示了可能受到影响的潜在细胞内靶点和通路。

在骨吸收过程中，破骨细胞内化相对高剂量的双膦酸盐（约10 μM）会导致细胞凋亡。为了探究BP对细胞的全面影响，他们用多种剂量和时间点的临床应用和新型BP处理了一系列人类细胞。考虑到BP家族的功能多样性，他们选择了七种典型化合物，分别代表不含氮（非N）的双膦酸盐（氯膦酸盐、依替膦酸钠）、含氮（N）的双膦酸盐（唑来膦酸、利伐沙班、阿仑膦酸钠）以及两种非临床应用的含氮双膦酸盐（OX14、 IG9402或利达膦酸钠），这些化合物对骨的亲和力和对纤维蛋白原合成酶（FPPS）的影响各不相同。他们在多种代表性组织类型的细胞中测试了这些化合物，包括与有益临床结果相关的组织（肺、心脏、血管、肾脏、肌肉、肝脏、前列腺、淋巴结和骨髓）（图5a）。

利用活细胞成像（IncuCyte）结合人工智能辅助的细胞融合度分析，低剂量（0.001 μM）、中剂量（0.1 μM）和高剂量（10 μM）的BP处理（持续4天）在多种细胞类型中呈现出截然不同的效果（图5b-c）。在高剂量BP处理下，大多数受试BP均能显著抑制细胞生长，与凋亡对照组的结果相似，也与大众对BP在破骨细胞中作用的理解相符。然而，低剂量BP（<0.01 μM）则能刺激细胞生长。具体而言，低剂量唑来膦酸处理显著促进了心肌细胞（28%）、心血管内皮细胞（9.4%）、肾脏上皮细胞（20.5%）、肝细胞（22%）、成肌细胞（8.7%）和单核细胞（21.1%）的增殖。RIS和非氮双膦酸盐 CLO 也观察到了类似的显著增加（图5d-e）。这些数据表明，BP可能作用于多种细胞类型，并有可能在较低剂量下产生有益作用。重要的是，由于含氮和不含氮的BP通过不同的细胞机制发挥作用，大多数BP刺激细胞生长的类似增加提示，可能存在联合或新的机制介导这种反应。

基于对BP处理的人类和小鼠衰老及细胞衰老现象的观察，他们检测了BP预处理是否能预防构建的非骨骼细胞系中的衰老诱导（图6a）。在诱导DNA损伤触发的衰老之前，将HUH-7、AC16、HL1、HEK和THP1细胞暴露于低剂量BP（0.001 μM）可防止细胞融合度下降，其中CLO、RIS和唑来膦酸在心肌细胞中表现出最高的保护作用（图6b-c）。此外，观察到蛋白质标志物发生显著变化，反映出衰老减少，包括 γ-H2AX、LaminB1、P16、IL6、TNF-α 的表达、细胞周期停滞（图6f-i）和 SA β-半乳糖苷酶染色（图6d-e），这些变化是在用唑来膦酸、CLO 或 RIS 进行预处理后发生的。

基于既往证据表明唑来膦酸治疗可改善骨质疏松患者的血浆蛋白质组，在体内多个器官部位诱导有益的转录组变化，并在体外低剂量下促进多种人类细胞类型（包括人源心肌细胞）的生长，优先选择唑来膦酸进行二维热分析，以研究其蛋白质组范围内的靶标谱。该方法通过施加热梯度，检测在靶标饱和化合物浓度下蛋白质的稳定性。首先，他们通过免疫印迹证实，在完整的A549、HEK、AC16和HUH7细胞中，随着温度升高（37-78 °C），唑来膦酸处理可使已知的唑来膦酸靶标法尼基焦磷酸合酶（FPPS）的稳定性增强。在所有四种细胞系中，AC16心肌细胞表现出最显著的热稳定性效应（图7a）。

不同浓度唑来膦酸（0-20 μM）处理下，不同温度下完整AC16心肌细胞的蛋白裂解液，并利用质谱和TP-MAP 101进行进一步分析，以鉴定可能因唑来膦酸结合而发生正向或负向（不稳定）改变的蛋白质。令人欣慰的是，在唑来膦酸处理后，能够鉴定出同源靶蛋白FPPS，它是8397个已鉴定蛋白质中得分最高的蛋白质（图7b）。此外，其他一些与BP无关的蛋白质（ASAH1、PHB2和FOSL1）在唑来膦酸处理后也显著稳定。他们对前4个蛋白质靶点分别进行了分子对接计算，以计算最稳定的结合位点和自由能，并利用精确的蛋白质结构和BP结合可视化（由AlphaFold生成）。正如预期，已知BP靶标FPPS的结合自由能最低（−12.19 kcal/mol），其次是ASAH1（−11.18 kcal/mol）、PHB2（−7.34 kcal/mol）和FOSL1（−7.0 kcal/mol），表明ASAH1和PHB2具有相对较高的结合亲和力（图7c）。PHB2是一种多功能蛋白，参与多种细胞过程，例如线粒体功能、细胞周期调控和细胞凋亡。ASAH1编码一种参与神经酰胺代谢的酶，在包括细胞信号传导和细胞凋亡在内的多种细胞过程中发挥作用，而FOSL1是AP-1转录因子复合物的关键组成部分，在调控细胞增殖、分化和肿瘤发生中起着重要作用。通过基于蛋白质印迹法的细胞热分析（图7d）进一步证实了 PHB2、ASAH1 和 FOSL1 的直接靶向结合，验证了 PHB2 和 FOSL1 作为有效和新型 BP 结合靶点的计算对接结果。

为了系统地探索与唑来膦酸稳定蛋白靶点相关的调控网络，他们对经唑来膦酸处理（0.001 μM，4天）或未处理的AC-16心肌细胞进行了RNA-seq和ATAC-seq分析，分别用于鉴定基因转录和染色质可及性的变化。利用STRING数据库构建了一个扩展的蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI），该网络源自PHB2和ASAH1。将所有与这些靶点相关的因子映射到RNA-seq、ATAC-seq和SomaScan蛋白质组学数据集，以鉴定所有分析中均存在的、且在ZOL暴露后于人体系统（体外和体内）中发生改变的基因或蛋白质。该整合分析表明，在已鉴定的唑来膦酸蛋白靶点下游存在四个潜在的调控因子（ESR1、MEF2A、JUN和KLF4）（图7e）。免疫分析证实了MEF2A的持续翻译效应，结果显示唑来膦酸处理后MEF2A蛋白表达增加（图7f）。MEF2A，即肌细胞增强因子2a，是一种转录因子，在肌肉发育和心血管生物学中发挥着核心作用，并发现能够抑制血管内皮细胞的衰老。同样，小鼠心脏转录组学和血浆蛋白质组学数据表明，MEF2A靶基因（Corin、Ablim1和Nduf10）及其相关蛋白（HMBS、BPGM和HIST2H2BE）在唑来膦酸处理后也上调，而心肌成肌细胞中PHB2的敲除则降低了MEF2A的水平（图7g）。为了验证MEF2A在介导ZOL细胞效应中的作用，他们还进行了MEF2A敲低实验。与载体对照组相比，MEF2A缺失显著降低了细胞生长，表明MEF2A对于维持心肌细胞活力至关重要，这与之前的研究结果一致。MEF2A沉默后，唑来膦酸诱导的促生长作用基本消失（图7h）。在丝裂霉素C（MMC）诱导的衰老模型中，MEF2A敲低并未改变MMC单独作用下的基线衰老反应，但显著减弱了唑来膦酸的抗衰老作用（图7i）。综上所述，这些结果表明PHB2-MEF2A轴是唑来膦酸介导细胞生长和抵抗MMC诱导衰老的潜在候选通路。

本研究利用一系列人体、小鼠和细胞评估方法，绘制了与衰老相关的全身和局部器官变化图谱。对接受唑来膦酸治疗的老年小鼠进行体内空间转录组学分析显示，其细胞组成向年轻动物的细胞组成转变，尤其是在心脏、肝脏和肠道中，同时上调了与解毒、线粒体稳定性、能量代谢和抗氧化相关的基因。一项基于5000个样本的随机对照试验的人体蛋白质组学分析显示，唑来膦酸治疗后约400种蛋白质发生显著改变，其中与基因组不稳定性、蛋白质稳态失衡、线粒体功能障碍、干细胞耗竭和SASP相关的蛋白质表达下调。荧光标记和示踪证实了非骨骼细胞对双膦酸盐的摄取。此外，低剂量的几种常用临床双膦酸盐可刺激多种人类细胞类型的生长，并保护其免受DNA损伤诱导的衰老，其中对心肌细胞的作用最为显著。最后，利用AlphaFold进行蛋白质组范围的靶点解卷积，鉴定出先前未知的结合蛋白，包括PHB2和ASAH1，并证实MEF2A的下游上调是唑来膦酸在心肌细胞中发挥有益作用的关键介质。综上所述，这些结果揭示了双膦酸盐在多种非骨骼组织中发挥抗衰老作用的潜在机制。