单细胞全基因组测序：解码抗癌治疗下转移性结直肠癌的克隆演化

一、为什么必须"单细胞"地读肿瘤演化史？

结直肠癌（CRC）是全球癌症死亡的主要原因之一。过去二十年，人们已经画出了它的突变全景图，也确认了肿瘤内部存在广泛的遗传异质性。但有一个关键问题始终没有解决：在化疗、放疗和器官微环境的持续选择压力下，肿瘤的"晚期克隆演化"究竟是怎样发生的？

瓶颈出在检测手段上。

传统研究大多依赖整块肿瘤组织测序（bulk sequencing）。它给出的只是"组织平均值"——一份肿瘤组织里成千上万个癌细胞被混在一起测，那些只存在于少数细胞里的晚期亚克隆突变，会被大量正常细胞和主干克隆的信号"淹没"，根本看不见。而单细胞全基因组测序虽然理论上能解决问题，但早期技术在基因组覆盖率和错误率上都不理想，点突变和基因组重排都难以准确检出。

这项研究换了一条更聪明的路：用类器官培养把单个癌细胞"养大"成克隆，再对每个克隆做全基因组测序（WGS）。由于每个克隆体都源自一个起始细胞，所有共享的体细胞突变就天然成了内源性"条形码"——用这些条形码，研究者可以重建出亚克隆的演化树，把突变按照"什么时候获得"逐一拆解到时间轴上。

二、研究设计：58 个克隆体 + 18 份组织，搭出高清演化树

研究纳入 6 位转移性结直肠癌患者（MC01–MC06，男女、年龄各异），采集了配对样本：

• - 58 个单细胞来源肿瘤类器官（tumoroid）克隆
• - 18 份整块肿瘤组织（8 份原发灶 + 10 份转移灶）
• - 6 份配对正常组织（血液） 作为对照
• - 测序平均深度 51×

▲ 图1｜研究设计与转移性结直肠癌克隆轨迹重建。a，研究流程示意：肿瘤样本经单细胞解离、克隆化培养（58 个肿瘤类器官）后进行全基因组测序与系统发育树重建；b–g，6 位患者（MC01–MC06）的克隆系统发育树与临床时间轴。每根彩色条的长度代表该分支上累积的单核苷酸变异（SNV）数量，颜色代表不同突变特征的相对贡献；蓝色与红色分别表示治疗前与治疗后样本；关键驱动突变被标注到对应分支上。

每个患者的肿瘤样本被一分为二：一半直接做整块组织测序，另一半用于建立肿瘤类器官。76 份肿瘤样本中，有 10 份组织和 46 个类器官属于治疗后样本——涉及 FOLFOX（5-氟尿嘧啶 + 亚叶酸钙 + 奥沙利铂）、FOLFIRI（5-氟尿嘧啶 + 亚叶酸钙 + 伊立替康）以及/或放疗。

分析结果的分辨率相当惊人：每个样本平均检出 13,418 个 SNV（范围 4,917–28,938）、1771 个短插入缺失和 98 个结构变异。用 SNV 作为谱系条形码重建的克隆树，与用结构变异重建的树拓扑一致，互相印证了推断结构的稳健性。

约 56% 突变在"主干"，44% 是"晚期"事件

在所有患者的演化树里，平均 56.0% 的体细胞碱基替换是"主干突变"——在患者所有肿瘤样本中共享，代表肿瘤发生早期就已获得；剩下的 44.0% 属于"晚期突变"，只局限在系统发育树的下游分支上。

一个符合既有认知的发现是：CRC 的经典驱动突变（TP53、KRAS、APC）绝大多数位于主干，或出现在演化树的第一个节点，说明它们主要参与肿瘤"起始"。但也找到了晚期驱动突变：例如患者 MC05 肝脏转移克隆中特有的 SMAD4 第 1 外显子纯合缺失。

转移，来自"单一的晚期亚克隆"

在 6 位患者的演化树里，转移克隆都共享一个晚期的共同祖先节点。这提示：远处转移很可能由单一亚克隆谱系主导，而不是多个并存克隆各自播散。

患者 MC02 的例子很能说明问题。他有 3 个同时性原发肿瘤，三者彼此只共享 16 个碱基替换，说明这三条谱系早在胎儿发育阶段就已分道扬镳——也就是三次独立的肿瘤发生。但肝脏转移组织和克隆，却只与其中一个原发灶（Primary3-FT，位于结肠肝曲）聚类，从而精准锁定了这个原发灶是唯一的转移来源。

研究还发现，腹膜、卵巢和淋巴结转移的克隆分歧时间，比肝转移更早——这与既往报道一致，提示不同转移部位的演化节奏并不相同。

三、抗癌治疗在癌细胞 DNA 上留下的"突变指纹"

化疗和放疗药物会造成特定类型的 DNA 损伤，从而在肿瘤基因组里留下可识别的突变特征（mutational signature）。这项研究用 COSMIC v3.2 等已知特征库，拆解了演化树主干和各个分支的突变构成。

▲ 图2｜抗癌治疗相关突变特征谱。a，热图显示各突变特征所对应的突变数量：前六行为治疗相关特征，其后为"时钟样"特征（SBS5/40、SBS1、SBS3）和其他特征（SBS13、SBS18、SBS37、SBS41）；颜色深浅对应右侧色标的突变计数，并区分"初治（Treatment naive）"与"化疗后（Chemotherapy-treated）"样本。b，克隆 MC06-Liver-O5（居中）的突变谱与特征拆解结果，化疗相关特征（SBScisplatin/oxaliplatin、SBSoxaliplatin、SBS17a、SBS17b、SBS25）位于上/中两侧，"时钟样"特征（SBS40、SBS1）位于左下，其他特征（SBS13、SBS41）位于右下。

结果非常清晰——治疗会在基因组里"签名"：

• - 5-氟尿嘧啶（5-FU）→ SBS17a / SBS17b：在接受 5-FU 暴露的肿瘤中显著升高（SBS17b 平均 398 vs 149，P=9.885e-05；SBS17a 平均 233 vs 85，P=0.0001），与肿瘤所在部位无关。
• - 奥沙利铂 → SBSoxaliplatin / SBScisplatin/oxaliplatin：在奥沙利铂暴露的类器官中常见。
• - 放疗 → IDradiation：这是一种此前从受辐照细胞基因组中建立的插入缺失特征，出现在接受放疗的患者 MC05 的类器官中。
• - 意外发现：SBS25：这一特征此前只在接受烷化剂（如丙卡巴肼、达卡巴嗪）治疗的霍奇金淋巴瘤中被观察到，本次却在接受 FOLFOX + FOLFIRI 的患者 MC06 治疗后类器官里检出。
• - 未检出伊立替康（拓扑异构酶 I 抑制剂）特异特征。

综合起来，研究者把 SBS17a/SBS17b（5-FU）、SBSoxaliplatin、SBScisplatin/oxaliplatin（奥沙利铂）和 SBS25 归为化疗相关碱基替换特征（SBSchemo）。平均而言，每个克隆携带约 1400 个 SBSchemo 碱基替换，占其总突变负荷的约 8.0%（范围 0.1–17.3%）。

四、克隆之间的"不平等"：增殖越旺，化疗"伤痕"越深

治疗相关突变的总量，整体上与化疗暴露时长正相关——平均每月化疗对应约 142 个 SBSchemo 突变（95% CI 116–167）。但这只是平均值，真正有意思的是克隆之间的巨大差异。

▲ 图3｜抗癌治疗下的不对称克隆演化。a，每样本 SBSchemo 突变数与化疗时长的关系（颜色代表不同患者）。b/c，患者 MC06（n=8，P=7.614e-07）与 MC04（n=19，P=5.090e-09）中 SBSchemo 与"时钟样"突变数的相关性。d，患者 MC03 中 SBSchemo 与 SBS3 突变数的相关性（n=12，P=6.831e-09）。e，外部队列（经化疗的正常血液细胞，n=41，P=5.972e-27）中两者的相关性。f，化疗对"增殖谱系"与"休眠谱系"突变影响的差异示意。g，克隆间比较的"一致（concordant）"与"不一致（discordant）"定义。h，三位患者中一致/不一致节点的饼图与汇总柱状图（P=9.413e-11）。i，患者 MC05 肝转移类器官克隆的系统发育树。j，MC05 中"治疗诱导休眠选择"的示意。

例如，SBScisplatin/oxaliplatin 特征只出现在 27 个接受奥沙利铂暴露类器官中的 5 个；来自 MC03 的 12 个类器官中，有 2 个克隆完全检测不到 SBSoxaliplatin；同一个体来源的治疗后类器官之间，SBS17b 负荷也差异悬殊。

为什么有的克隆"伤痕累累"，有的却"毫发无伤"？ 答案指向了细胞分裂次数。

研究者发现，SBSchemo 的多少，与克隆中"时钟样"内源突变（SBS1、SBS5/40）的数量高度正相关——而这两类特征正是与细胞增殖和年龄密切相关的。在 MC04、MC06 中，SBSchemo 负荷高的克隆，其 SBS1/SBS5/40 突变数也显著更高（如 MC06：n=8，P=7.614e-07；MC04：n=19，P=5.090e-09）。

这一规律在外部数据集中也成立：275 个来自 4 位正常血液供者的克隆、12 个来自 2 位正常结肠上皮供者的克隆，都呈现同样的趋势。

这从演化树结构上也能看出来：产生更多子代克隆的"姐妹谱系"，倾向于累积更多突变——即所谓的"优势亚克隆"。在 MC03、MC04、MC06 中，"突变负荷更高、且产生了更多子代克隆"的一致（concordant）节点显著多于不一致节点（P=9.413e-11）。

一个反向验证：MC05 的"休眠选择"

最有力的反例来自患者 MC05。他接受了长时间的 FOLFOX + FOLFIRI，但所有克隆里都检测不到 SBSchemo 突变，取而代之的是 878 个 IDradiation（放疗相关）插入缺失，且水平与既往报道的辐照正常细胞相当（约 12 个 indel/Gy）。

研究者给出的解释是"治疗诱导的休眠选择"：如果化疗对增殖旺盛或易受损的癌细胞施加了强烈的负向选择，那么治疗后残留的肿瘤组织就会以休眠谱系为主——而电离辐射是物理诱变剂，能穿透细胞核损伤 DNA，无论细胞是否在分裂。因此，治疗后存活下来的休眠克隆会带有辐射相关突变、却缺少化疗相关突变，并在演化树上失去不对称性。

五、晚期驱动突变：趋同演化与"丢失"的癌基因

在克隆演化过程中，研究者观察到了大量驱动突变的获得与丢失，其中最具启发性的是趋同演化（convergent evolution）——不同谱系独立、反复地改变相同基因。

▲ 图4｜克隆演化过程中的晚期驱动突变。a，患者 MC02 三个同时性原发肿瘤中驱动突变的趋同演化（APC、KRAS、TP53、MYC 标注在演化树上）。b，Primary1-FT（上）与 Liver-O4（下）第 8 号染色体的等位基因特异性拷贝数图谱，MYC 位点由虚线标出。c–e，患者 MC04 中 ERBB2 突变的演化：等位基因特异性拷贝数变化映射到演化树上（等位基因 A 橙色、B 蓝色），标注了拷贝数扩增、T862A 热点突变（绿星）与断裂-融合-桥（BFB）事件（c）；不同部位的 ERBB2 等位基因平均拷贝数（d）；ERBB2 位点的拷贝数-重排断点图（e）。f，患者 MC04 原发肿瘤克隆中 SMAD3 的逐步功能丧失。g，患者 MC06 中 NRAS 突变的丢失。

• - MC02 的"平行剧本"：三个同时性原发肿瘤独立地获得了 TP53、APC 等抑癌基因的功能丧失突变，还各自发生了独立等位基因的 MYC 癌基因扩增——说明早期肿瘤发生时就存在对相似致癌驱动的平行选择。
• - MC04 的 ERBB2 三重打击：肿瘤至少独立发生了 3 次 ERBB2 改变——包括丝氨酸/苏氨酸激酶结构域热点突变 T862A 和两次扩增事件：① 断裂-融合-桥（BFB）循环把 T862A 突变等位基因局部扩增到 6–17 个拷贝；② T862 野生型等位基因的全染色体扩增。有趣的是，BFB 扩增子常在肝转移及部分原发克隆中丢失，且这种丢失在演化树上至少独立发生了 3 次，可能源于两种扩增事件之间的功能冗余。
• - 逐步的功能丧失：SMAD3 先在 15q 臂发生拷贝数中性杂合性缺失（LOH），随后在扩增等位基因上获得移码突变，野生型等位基因进一步丢失，最终在部分原发肿瘤克隆中实现纯合失活。

最颠覆的一笔：肿瘤会"丢掉"驱动突变

在患者 MC06 中，原发灶存在 NRAS G12D 突变，但肝脏转移克隆却通过一次染色体臂的大片段缺失把该突变丢掉了。

六、复杂基因组重排：一次"灾难"之后，还会继续演化

复杂基因组重排（CGRs，如染色体碎裂 chromothripsis）通常被认为是单次灾难性事件。但得益于克隆类器官的高分辨率，研究者发现：有些重排在晚期克隆演化中会继续"加码"。

▲ 图5｜复杂基因组重排的演化。a–c，患者 MC06 中 CGR 的逐步重建：演化树上的灰色编号框表示各次事件，受放疗影响的事件已标注（a）；各分支特异的重排以示意图呈现（b）；二次染色体碎裂对应的拷贝数图谱与重排断点（c）。d–e，患者 MC03 中携带 MDM2 的染色体外 DNA（ecDNA）的演化，编号彩框表示定义 ecDNA 亚克隆的突变（d），各克隆的 ecDNA 拷贝数（e）。f，患者 MC03 与 MC06 中 RBFOX1 位点的反复大片段缺失。g，不同队列中 RBFOX1 大片段缺失的发生率（成纤维细胞 n=332、正常结肠上皮类器官 n=406、转移性 CRC 类器官 n=76）。

• - MC05 的"重排叠加"：早期演化中发生两次独立 CGR（1 号与 13 号染色体；6 号与 19 号染色体），形成的两条衍生染色体在各自复制后，又重排成一条双着丝粒染色体，随后发生二次 CGR，产生新的聚集性断裂点和拷贝数改变。类似的"重排之后再生重排"也见于 MC03 和 MC06，提示经历过 CGR 的基因组区域，在克隆演化中更易发生再次重排。
• - ecDNA 的动态演化：在 MC03 中追踪到驱动 MDM2 局部扩增的染色体外 DNA（ecDNA）演化——它很可能源自多染色体染色体碎裂。虽然原发灶与肝转移的整体 ecDNA 拷贝数一致（P=0.8375），但克隆间发生了序列层面的替换：在 Liver2-O4 与 Liver2-O5 中，旧的 ecDNA 池被新的突变型 ecDNA 取代，提示 ecDNA 组成会在克隆演化中"动态漂移"。
• - RBFOX1 反复缺失：研究在两个患者（MC03、MC06）、7 个肿瘤病灶、17 个 CRC 样本中发现 RBFOX1 大片段缺失（发生率 22.4%，显著高于正常结肠克隆的 1.5%，P=5.662e-26）。缺失片段大小 2 kbp–470 kbp，常跨越 RBFOX1-010 转录本的第 3 外显子；15 个样本（19.7%）甚至出现3–4 个并发的 RBFOX1 缺失——这超出了抑癌基因"二次打击"假说的预期，提示该基因组区域在 CRC 中天生脆弱。RBFOX1 编码一个参与可变剪接的 RNA 结合蛋白，具有单倍剂量不足特性，有望成为 CRC 特异性的候选驱动基因。

七、LINE-1"跳跃基因"：跟着细胞分裂一起累积

最后，研究者考察了长散在核元件-1（LINE-1 或 L1） 这种人类基因组里的"跳跃基因"在克隆演化中的活动。

▲ 图6｜克隆演化中的 L1 逆转座。a，L1 逆转座机制示意（含转导）。b，各克隆的体细胞 L1 逆转座（soL1R）总负荷。c，每个 SBSclock-like 突变对应的 soL1R 率在主干与分支间无显著差异（ns）。d–e，患者 MC04（d）与 MC06（e）中不同 L1 来源元件的活跃情况，右侧环形图标注各 L1 来源。

• - 研究共检出 1138 个体细胞 L1 逆转座（soL1R）事件，平均每个克隆 104 个（范围 8–291）——远高于正常结直肠类器官的"每个克隆 3 个"，说明肿瘤中 L1 活性显著增强。
• - 其中 224 个（20%）是发生在"主干"上的早期事件。
• - 分支 soL1R 负荷与化疗暴露呈广泛正相关，但个体间和克隆间差异巨大（例如 MC04 中 soL1R 负荷并不随化疗时长明显上升）。
• - 关键规律：soL1R 负荷同样与时钟样内源突变正相关。若把 soL1R 归一化到时钟样突变数（即"每个细胞分裂对应的 soL1R 率"），会发现主干与分支之间没有显著差异（11.5 vs 10.9，P=0.9409）。

研究还捕捉到一些同一 L1 来源元件在不同时间/个体间"开关切换"的现象：例如 22q12.1-2 这一来源，在 MC04 中于化疗后分支被"激活"，而在 MC06 中却在主干活跃、分支沉寂——说明每个 L1 来源的活性会在克隆演化中随时间变化。

八、这项研究对临床意味着什么？

1. 精准量化了治疗相关突变

   ：以往基于 bulk 组织的研究估计每月化疗累积"数百个"突变，但单个细胞层面的真实负荷一直不清楚。本研究首次在单细胞水平量化了每个克隆约 1400 个化疗相关碱基替换（约占总负荷 8%），并揭示其在不同克隆间极不均衡。

2. "休眠"可能是化疗耐药的关键

   ：更多分裂的克隆累积更多化疗突变，而休眠克隆几乎"免疫"于化疗突变。这为肿瘤休眠作为化疗耐药机制提供了基因组层面的直接证据，也提示"诱导或打破休眠"可能成为新的治疗思路。

3. 驱动突变的"动态得失"要求动态用药

   ：像 MC06 那样转移灶丢失 NRAS 突变、却因此错失 anti-EGFR 治疗机会的案例，说明仅凭原发灶或单次活检决定靶向治疗可能并不充分，需要结合克隆演化的时间维度。

4. 新候选靶点与脆弱位点

   ：RBFOX1 反复缺失、ecDNA 的克隆漂移、CGR 的持续演化，都为理解 CRC 的晚期侵袭与耐药提供了新的切入点。

九、方法学启示：为什么"单细胞 + 类器官"值得关注

这项研究最值得国内同行借鉴的，是它的方法学组合拳：

• - 单细胞分离 + 类器官克隆扩增 + 全基因组测序，用共享突变作"内源条形码"，把"看不见的晚期亚克隆"变成"看得见、测得到"的独立个体；
• - 突变特征拆解（signature decomposition） 把治疗暴露"翻译"成基因组语言；
• - 整块组织与单细胞克隆互为对照，既能验证克隆谱系在组织中的真实存在，又能识别组织测序"看不见"的少数谱系。

十、写在最后

从"组织平均值"到"单细胞个体"，我们对肿瘤的理解正在从快照走向电影。这项研究告诉我们：肿瘤不是一个静止的整体，而是一个在治疗压力下不断分化、竞争、甚至"丢弃"自身驱动突变的动态生态系统。

理解了这套"演化规则"，我们才可能真正回答那个临床难题——为什么有的癌细胞被彻底杀死，有的却能"潜伏"多年后卷土重来。

参考文献：Lee WH, Kim B, Nam CH, et al. Clonal evolution and mutational trajectories of metastatic colorectal cancer shaped by anticancer therapies. Nature Communications, 2026, 17:7509. DOI: 10.1038/s41467-026-74384-3