文献解读 |Nature （ 48.5 ）：成年期、衰老和阿尔茨海默病中的人类海马神经发生

人类海马神经发生是否存在一直存在争议，其在认知中的作用也尚不明确。近期研究证实了增殖性祖细胞和未成熟神经元的存在，并发现阿尔茨海默病（AD）患者海马中未成熟神经元的数量减少。然而，这些神经元的起源以及调控神经发生和功能的分子网络仍知之甚少。

为了建立成人大脑神经发生的调控通路，研究团队首先分析了来自8名认知功能正常的20-40岁成年人（YA队列）的85977个细胞核的测序图谱。为了确保细胞注释的可靠性，他们使用了基于单细胞变异推断（scVI）中实现的机器学习标签迁移算法——基于变异推断的单细胞注释（scANVI），将标签从两个人类大脑单细胞转录组分析（scRNA-seq）数据集迁移过来：一个是人类发育前脑数据集，另一个是成人海马体数据集。基于单细胞核转录组分析(snRNA-seq)的无监督聚类分析揭示了海马体中存在12种细胞类型，包括神经母细胞和未成熟神经元。在二维均匀流形近似和投影（UMAP）可视化中，未成熟神经元出现在成熟颗粒神经元聚类的外缘。神经母细胞聚类与成熟少突胶质细胞（mOL）聚类部分重叠。对这两个细胞聚类进行差异表达基因（DEG）和通路分析，结果显示共有4166个DEG和169条通路，所有这些基因和通路在神经母细胞中的表达均高于mOL。其中，80条通路与树突、轴突、突触后致密区和神经递质传递通路相关。因此，为了确定这两个细胞聚类相似性的本质，他们检测了基于scRNa-seq的人类脑图谱中观察到的替代指标的表达水平，少突胶质细胞相关替代指标，例如髓鞘相关糖蛋白（MAG）和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG），在神经母细胞中也有表达，但表达水平低于mOL。这一发现或许可以部分解释 UMAP 上聚类在视觉上的接近性，即使它们的基因表达谱明显不同。

为了鉴定神经干细胞（NSC）及其发育轨迹，他们利用RNA速率分析了星形胶质细胞、神经母细胞、未成熟颗粒神经元和成熟颗粒神经元聚类的潜伏期。该方法基于新生mRNA与成熟mRNA的比值，分析细胞分化水平与mRNA半衰期之间的关联。他们观察到几个亚聚类。机器学习鉴定的未成熟神经元的潜伏期短于成熟颗粒神经元。他们还确定了两个潜伏期长于星形胶质细胞但短于未成熟神经元的亚聚类。其中一个亚聚类验证为上述鉴定的神经母细胞聚类。对另一个亚聚类与星形胶质细胞进行比较，发现与其余星形胶质细胞相比，该亚聚类存在766个DEG（671个上调，95个下调）。通路分析显示，65条通路中有25条与神经元发育相关，包括轴突发育、郎飞氏结、起始段、生长锥、轴突导向、树突棘和突触后致密区。将该聚类命名为NSC。RNA速率分析揭示了从NSC到星形胶质细胞亚聚类的定向流动，然后经由未成熟神经元流向神经母细胞，最终到达成熟的颗粒神经元。这一发现支持了成人海马中存在发育轨迹。与啮齿动物的研究结果类似，与神经母细胞和未成熟神经元相比，人类NSC表达高水平的干性标志物和低水平的神经元标志物。值得注意的是，转座酶可及染色质单细胞核测序（snATAC-seq）分析能够通过染色质可及性对干性进行正交评估。在NSC中与多系分化潜能相关的区域具有较高的染色质可及性，而神经元成熟指标则在神经母细胞和未成熟神经元中表现出高水平的开放染色质。将神经发生特征与先前在人类齿状回中观察到神经发生的研究进行比较，结果显示两者高度一致。他们进一步将神经发生特征应用于预期不会发生神经发生的大型scRNA-seq全脑数据集，从而验证了该特征。该分析证实了神经源性特征具有很高的特异性。

NSC中的主要DEG和差异可及区域（DAR）在神经母细胞中表达下调，并在未成熟神经元中进一步下调（图1a-b）。相反，神经母细胞中的主要DEG和DAR在NSC中表达下调（图1a-b）。其中一些基因在未成熟神经元中进一步上调，而另一些基因则维持其表达水平或下调。在未成熟神经元中鉴定的主要DEG的表达水平在NSC中较低，在神经母细胞中中等，这一结果与该发育过程中转录组谱的转变相一致（图1a-b）。发育通路，例如β-catenin和基底外侧质膜，在NSC中富集，而在神经母细胞和未成熟神经元中下调。在未成熟神经元中富集的通路与突触功能和可塑性相关（图1c）。基序富集统计显示，NSC中的主要基序是经典信号转导家族STAT转录因子（TF；例如STAT3、STAT4和STAT5）、PLAGL1和NFIB。相比之下，在未成熟神经元中，这些基序是RFX2、FOS-JUN、NFE2、MEIS2和PBX2（图1d）。这种模式表明，在神经干细胞中促进干细胞维持和增殖的转录因子活性，在未成熟神经元中则转变为调节神经元分化和成熟的转录因子活性，这一发现进一步支持了海马发育轨迹的观点。配对的snRNA-seq和snATAC-seq数据的可用性使他们能够利用TF-peak-基因三联体方法和增强子驱动的GRN确定神经发生的GRN。神经发生轨迹显示，NSC中最强的相互作用在神经母细胞中下调，并在未成熟神经元中进一步下调。相反，NSC中不存在的相互作用在神经母细胞中轻微上调，并在未成熟神经元中上调程度更大。相互作用的强度在所有细胞类型中均有所变化，但其调控方向保持一致。不同的eRegulons网络调控着不同的细胞类型。NSC中最显著的eRegulons包括RORA、RORB、SMAD1、ZNF98、SOX6、PRRX1、NFIA、GLIS3、BCL6和ETV6。在神经母细胞中，这些基因包括ZNF740、ZNF180、THRA、NFE2L1、NEUROD1、FEZF2、EGR1、EGR3、E2F1以及NRF1的抑制因子。在未成熟神经元中，主要的 eRegulons 包括ZNF589、ZNF519、TFDP1、ONECUT2、MTF2、MTA3、GLIS1和E2F3以及SOX2和MXI1的抑制因子（图1e）。总之，这些单核多组学分析构建了成人大脑神经发生的多方面分子框架。

为了研究年龄和认知诊断对神经发生的影响，他们对来自健康老年人（无认知障碍，HA组）、可能从HA过渡到AD的临床前期中间病理阶段（PCI组）以及AD患者（的海马体分离的细胞核进行了测序。此外，他们还分析了来自“超龄组”（SA组）的海马体样本；这些个体为80岁及以上，且情景记忆测试表现等于或优于50-59岁人群的个体。YA组中观察到的所有细胞类型在其他组中均有检出（图2a）。然而，与HA组相比，PCI组和AD组的NSC数量显著增加。此外，与HA组和YA组相比，AD组的神经母细胞和未成熟神经元的平均数量显著减少。与PCI组相比，AD组的未成熟神经元数量也显著减少。与DEG相比，大多数由年龄和诊断驱动的神经发生改变体现在DAR的数量上，这表明染色质可及性的表观遗传差异比mRNA表达差异更能代表认知老化的分子特征。具体而言，大多数DEG存在于NSC中，仅有172个DEG区分了AD组和HA组，6个DEG区分了AD组和PCI组，154个DEG区分了AD组和YA组，18个DEG区分了SA组和其他诊断组。NSC中上调或下调的DEG和DAR的数量与年龄和诊断大致相等。对所有神经源性细胞中DEG和DAR的分析（按诊断分组）显示，AD组的基因和开放染色质区域的表达方向与其他组相反（图2b-d）。基于DAR的基序富集分析表明，在差异可及染色质区域中鉴定出的主要基序属于锌指转录因子家族，而下调最显著的基序属于调控因子X（RFX）家族，这两个家族都是发育、细胞生长和分化的关键驱动因子（图2e）。值得注意的是，与YA、HA和SA组相比，PCI队列中神经母细胞和未成熟神经元中存在一组特异性下调的DAR。这些DAR在AD组中进一步下调。PCI中染色质可及性的这种改变先于相应RNA表达谱的变化。他们将这些峰值与GRN分析相结合，以鉴定靶基因，随后进行通路富集分析。该过程表明，大多数通路与神经元结构和功能的维持、突触可塑性和神经元发育相关（图2f-g）。综上所述，这些结果表明，DAR的下调会诱导神经发生改变，而这种改变与认知衰退相关，并且最早随年龄增长而发生的改变发生在NSC中。此外，AD 组中神经母细胞和未成熟神经元中的大多数 DAR 和 DEG 都显著下调，与突触可塑性和神经传递相关的 DAR 可能作为神经发生病理改变的早期标志。

接下来，他们试图确定调控衰老和疾病过程中神经发生改变的GRN，他们利用SCENIC+用于推断增强子驱动的GRN（eGRN）确定了这些过程的增强子调控子（eRegulons）。基于eRegulon的UMAP可视化显示，NSC构成了一个独特的聚类（图3a），这一结果进一步突显了NSC在GRN水平上的特征性分子标记。SCENIC+基于eRegulon的扩散分析验证了这一发现，该分析基于eRegulon揭示了NSC、神经母细胞和未成熟神经元之间的谱系连续性（图3b-d）。为了识别与认知衰退中神经发生相关的eRegulons，他们比较了PCI组和AD组与HA组相比，在两者中发生显著改变的eRegulons。与PCI组和AD组相比，HA组中驱动神经发生的eRegulons存在显著差异（图3e）。在HA组中驱动神经发生的六个主要eRegulons中，有五个在PCI组和AD组中表达下调。相反，另一组eRegulons在PCI组中表达上调，并在AD组中进一步上调。值得注意的是，在七个上调的eRegulons中，有五个（ZNF98、SMAD1、RORB、PRRX1和NFIA）是YA组中NSC的主要eRegulons（图1e）。这一发现可能部分解释了AD组中NSCs数量的显著增加。对HA、PCI和AD组中细胞类型特异性eRegulons的分析表明，这一结果可能是由于与HA组相比，PCI和AD组NSC中NFIA抑制因子的下调所致（图3f）。此外，这三个认知障碍组中NSC的调控由不同的激活因子和抑制因子eRegulons组成。具体而言， PCI组中ZNF565和ONECUT2激活因子以及SOX6、PAX6和ARNT2抑制因子表达上调。在AD组中，这些因子由RXRG、RARG、NFIC和KLF5激活因子所取代（图3f）。对所有诊断条件的分析揭示了几个值得注意的发现。首先，SA与其他所有条件相比具有独特的特征，其中TFDP1激活因子ONECUT2和GLIS1以及抑制因子SOX2、MXI1和FOXO3均上调。其次，存在一组激活因子特征，这些因子在AD中特异性上调，而其他因子则显著下调，包括ZNF98、ZNF423、ZIC1、RORB、RARG、PAX6、NFIA和CPSF4。第三，存在一组受衰老驱动的特征，特别是激活因子ZNF580、SOX15、IRF3、E2F4和CHURC1（图3g）。综上所述，这些结果表明，认知诊断相关的神经发生改变是由不同的GRN组合驱动的，这些组合代表了顺式调控元件、转录因子和靶基因之间网络相互作用的改变。

在确定认知衰退过程中神经发生发生改变后，他们接下来试图确定认知韧性的特征，尤其是在SA组中。对SA组的细胞丰度分析显示，与其他组相比，SA组中未成熟神经元的数量显著增加。然而，他们担心这种效应主要归因于一个未成熟神经元数量异常高的样本。但是，即使排除该样本，他们仍然观察到未成熟神经元数量增加了2.5倍。SA组与AD组相比，未成熟神经元的丰度差异具有统计学意义。SA组与HA、YA和PCI组的比较显示，SA组中未成熟神经元的数量增加了约两倍，尽管这一结果并不显著。他们还观察到SA组中的神经母细胞数量显著高于AD组。对SA组神经发生特征的分析表明，这种独特的未成熟神经元和神经母细胞谱主要归因于DAR。具体而言，与其它组相比，SA组中未成熟神经元中有7058个DAR上调，神经母细胞中有674个DAR上调。相比之下，在NSC中观察到的改变很少（图4a-b）。少数关键基因在神经母细胞和未成熟神经元中上调，例如BDNF（编码脑源性神经营养因子）和CALB1（图4a）。下调基因包括NEUROD6和NECTIN3 ，它们与载脂蛋白E（APOE）相关，参与突触可塑性（图4a）。为了验证神经发生过程中是否存在韧性特征，他们计算了韧性评分。韧性评分旨在识别AD组中DEG和DAR相对于YA、HA和SA队列的一致性效应模式。他们计算了每次比较的差异倍数，韧性评分是这些倍数变化的几何平均值。在神经母细胞和未成熟神经元中观察到了明显的韧性特征，其中大多数基因和峰值在YA、HA和SA中表现出稳定的表达水平，而在AD中则显著下调。这种模式在开放染色质区域尤为显著（图4c-e）。在NSC中，一些基因和峰值的表达水平随年龄或认知诊断而变化（图4c-e）。在NSC中，每种细胞类型中排名前500的韧性基因所富集的通路均与细胞增殖和生长过程相关。在神经母细胞中，排名前500的通路是线粒体和内体通路以及突触小泡内吞作用。在未成熟神经元中，这些通路是RNA结合和蛋白质结合、胞质和轴突通路（图4f）。在未成熟神经元中排名前500的韧性开放染色质峰中富集的基序包括锌指蛋白的转录因子，这些转录因子与促进神经元分化有关（图4g）。为了鉴定认知韧性的最强网络，他们检测了SA组中排名前500的eRegulons，观察到YA组和SA组之间存在共同的eRegulons特征（图1e和图4h）。具体而言，与YA组类似，SA组NSC中的主要激活因子为ZNF98、SOX6、RORB、PRRX1、ETV6和BCL6，共同的抑制因子为SOX2和MXI1（图4h）。同样，YA组和SA组的未成熟神经元也具有以下共同的激活因子eRegulons：ZNF589、TFDP1、ONECUT2、MTF2、MTA3、GLIS1和E2F3。共同的抑制因子为SOX2和MXI1。SA组的样本也表现出独特的eRegulons。未成熟神经元中的激活因子 eRegulon PROX1和NSC中的ZNF423、ZIC1、SOX2和NFE2L2均参与调控。此外，SA 组的NSC还表现出一系列在 YA 组中不活跃的抑制因子。

值得注意的是，在 YA 组中，神经母细胞表现出强烈的与分化相关的eRegulon特征，该特征由NEUROD1、FEZF2、EGR1、EGR3、E2F1和THRA驱动（图1e）。这种协调的调控程序在 SA 组中完全缺失，SOX2和NFE2L2是 SA 组中唯一发挥作用的激活因子。相反，SA 组的神经母细胞表现出一系列在 YA 组中不活跃的抑制因子。综上所述，该结果表明YA组和SA组中调控神经发生的转录组图谱发生了转变（图4h）。与其他所有诊断队列相比，SA组独特的eRegulon特征也十分明显。在未成熟神经元和神经母细胞中，抑制因子和大多数激活因子显著下调，同时特定eRegulon集合显著上调。在神经母细胞中，这包括NEUROD1和NRF1抑制因子下调，以及FOXO3和MXI1抑制因子上调。值得注意的是，NSC中的大多数激活因子和主要抑制因子均下调，这可能部分解释了SA组NSC中DEG和DAR数量稀少的原因。鉴于这些结果，他们接下来探究SA的独特特征是否由衰老驱动。虽然SA的特征表现出一些衰老效应，但大多数变化与衰老无关。具体而言，在NSC中，激活因子E2F1和抑制因子NFIB在HA组和SA组中均下调；因此，这些因子可能代表衰老引起的神经发生改变。同样，在YA组中占主导地位的激活因子CEBPZ在HA组和SA组中也下调。然而，与HA组相比，SA组的NSC和未成熟神经元由一组独特的eRegulons驱动，特别是NSC中激活因子ZBTB21、NFE2L2、MBNL2、FOS、EGR4和EGR1的上调，以及未成熟神经元中激活因子ZBTB7A、NFE2L1、ELK1和EGR3的上调（图4i）。但是，不能排除在SA组样本中检测到的独特eRegulons是衰老驱动的改变所致的可能性。为了支持这一理论，HA组和SA组的神经母细胞特征相似（图4i）。综上所述，这些结果揭示了一个调控SA神经发生的特定分子网络，该网络可能有助于提高认知能力。

接下来，他们试图确定维持海马认知完整性（HIPPI）或导致病理性衰老的分子信号。为此，检测了在SA组与HA组相比差异表达的信号，以及在PCI组与HA组和YA组相比呈现相反趋势的信号。他们观察到1001个DEG和579个DAR。大多数DEG出现在CA1神经元中，而大多数DAR出现在星形胶质细胞中（图5a-b）。在少突胶质细胞前体细胞（OPC）和mOL中也观察到DEG和DAR的显著改变（图5a）。值得注意的是，在CA1神经元中最显著的HIPPI中，包含一些在神经元功能和神经传递中发挥作用的基因（图5c）；例如，GABRB1、NRGN和KCNF。值得注意的是，小胶质细胞中的APOE、EGR1和GRASP，它们将包括1型代谢型谷氨酸受体在内的受体与神经元蛋白连接起来。此外，还发现了以下关联：抑制性神经元中的谷氨酸代谢型受体GRM8；以及成熟颗粒细胞（mGC）中的KCNE、GRIN2B、GRIA1和GRIK1。这些结果共同表明，维持高效的神经传递、突触可塑性和氧化还原平衡对于成功的认知老化表型至关重要，而它们的破坏则标志着向PCI的转变。除了突触和细胞稳态之外，对CA神经元中HIPPI基因的通路分析还揭示了胞质核糖体通路、能量代谢以及线粒体、内体和溶酶体通路（图5e）。星形胶质细胞中的DAR及其基序分析揭示了大量的FOS-JUN碱性亮氨酸拉链因子（bZIP）（图5d-f）。

为了研究HIPPI DEG和DAR对神经发生的影响，他们对神经发生细胞、星形胶质细胞和CA1神经元的配体-受体信号通路进行了CellChat分析。他们分析了每个诊断组在星形胶质细胞和CA1神经元中的GRN，并计算了不同诊断组间相同转录因子-峰值-基因相互作用强度的“衰老评分”。最重要的通路与突触复合物神经连接蛋白-神经配体蛋白（NRXN1-NLGN）相关，包括阿尔茨海默病相关钙黏蛋白样钙连接蛋白（例如NRXN1-CLSTN1和NRXN1-CLSTN2）、NCAM1、接触蛋白（CNTN）、APP-SORL1和谷氨酸能受体（例如Glu-SLC17、GRIA、Glu-SLC17、GRIK2和Glu-SLC17、GRM）（图5g-h）。SA组和HA组中增强的突触黏附和谷氨酸能通讯与PCI组和AD组中的减弱形成对比。该结果表明，维持兴奋性突触的完整性是健康认知老化的标志，也是预防认知衰退的潜在干预靶点。

本研究分析了来自不同人群的死后人类海马组织：记忆力完好的年轻成年人、认知功能正常的年长者、记忆力超群的年长者、处于临床前期病理阶段的成年人以及AD患者。本研究利用多组学技术，分析了从海马样本中分离的细胞核谱系，并鉴定了NSC、神经母细胞和未成熟颗粒神经元。神经发生失调主要与染色质可及性的改变相关。对区分各组的转录因子和靶基因特征的分析揭示了临床前AD患者神经发生细胞染色质可及性的早期改变，而这种改变在AD患者的样本中更为明显。本研究发现了一种独特的神经发生谱系，这可能反映了一种“韧性特征”。最后，星形胶质细胞和CA1神经元谱系的改变调控着衰老海马的认知功能。总之，本研究揭示了海马的多组学分子特征，该特征能够区分衰老过程中的认知韧性和衰退。