文献解读|Nat Genet（29）：整合多组学分析揭示了代谢功能障碍相关性脂肪性肝炎进展过程中巨噬细胞的独特改变

肥胖在引发低度全身性慢性炎症（包括巨噬细胞活化）中起着关键作用，并且是代谢功能障碍相关性脂肪肝（MASLD）发展的主要驱动因素。MASLD，称为非酒精性脂肪肝（NAFLD），是一种慢性进行性疾病，与代谢综合征的特征密切相关，其特征是肝细胞内甘油三酯过度积累。它涵盖了一系列疾病状态，从脂肪变性（MASL 或“脂肪肝”）到活动性脂肪性肝炎（代谢功能障碍相关性脂肪性肝炎，MASH）。后者以小叶炎症和肝细胞气球样变性以及不同程度的纤维化为特征。因此，由于其可进展为肝硬化和肝细胞癌，MASH 已成为肝移植的重要适应症。MASLD是一种影响超过30%人口的慢性疾病，然而，从脂肪变性到脂肪性肝炎（代谢功能障碍相关性脂肪性肝炎，MASH）过程中巨噬细胞组成的动态变化仍不清楚。

为了阐明MASLD进展过程中人肝脏中髓系细胞的异质性，研究团队对来自健康瘦人（体重指数（BMI）≤ 25，n  = 4）、健康肥胖人（BMI ≥ 35，n  = 5）、MASL（n  = 4）和MASH（n  = 5；纤维化分期1/1/1/2/2）患者的肝脏样本进行了单细胞核转录组分析(snRNA-seq)（图1a）。所有活检样本均进行了组织学检查，并根据组织学结果分为瘦人、肝脏组织学正常的肥胖人、MASL和MASH四类。从冷冻保存的样本中提取细胞核后，他们采用基于液滴的单细胞基因表达分析流程，最终获得了包含176150个高质量细胞核的数据集。根据该数据集，可以注释到八种主要的肝细胞类型，即肝细胞、胆管细胞、内皮细胞、间充质细胞、淋巴细胞、髓系细胞、B细胞和浆细胞样树突状细胞（pDC）（图1b）。值得注意的是，数据在不同患者和组别之间整合良好，未显示明显的批次效应或质量效应。对肝细胞进行进一步的亚聚类分析揭示了一种与其区域分布相关的分类，包括小叶中心区、小叶间区和门周区。有趣的是，IL32（一种在进展性MASLD中内质网应激的标志物）在所有MASH肝细胞中均升高。此外，淋巴细胞、间充质细胞和内皮细胞根据其基因表达进一步细分。对髓系细胞群的深入分析揭示了八个转录组不同的亚群。其中最显著且最常见的是库普弗细胞（KC），其特征是表达MARCO和CD5L。第二个巨噬细胞群富含多种吞噬、脂质代谢和胆固醇代谢标志物（GPNMB、HS3ST2、LPL、FABP5），因此命名为代谢活跃巨噬细胞（MetMac）。此外，过渡性巨噬细胞（TransMac；STAB1、MGAT4A）和前巨噬细胞（PCNX2、ADAM28、RUNX2）在转录组上与单核细胞（VCAN、FCN1）和成熟巨噬细胞具有相似性。还鉴定出各种常规树突状细胞（cDC）亚型，包括 cDC1（CLNK，CLEC9A）、cDC2（CD1C）和迁移性树突状细胞（migDC；LAMP3、CCR7）（图1c-d）。在分析从瘦到MASH的髓系细胞群谱时，细胞组成的逐渐变化变得明显（图1e）。在MASLD中，migDC和TransMac的数量增加，而在肥胖中，单核细胞的数量则有所升高。此外，使用miloR软件包对细胞邻域进行差异丰度检测发现，在MASLD期间，KC的数量显著减少，而MetMac的频率升高（图1e-f）。与KC不同，MetMac在MASH发展过程中表现出独特的反应，其特征是与脂肪酸代谢相关的基因，特别是脂蛋白脂肪酶（LPL）（图1d-g）的上调。此外，MASH-MetMacs和单核细胞的转录谱向炎症反应转变，表现为趋化因子生成、细胞因子信号传导、抗原呈递和巨噬细胞活化的活性增强（图1g）。此外，MASH期间MetMacs的促炎性转变与肝细胞、内皮细胞、间充质细胞、CD4+和CD8 + T细胞之间更广泛的细胞间相互作用相关，表明它们在MASH发展过程中的细胞间通讯中发挥着重要作用。这些snRNA-seq结果表明，随着MASH的进展，细胞群和表型谱发生了变化。

为了阐明进展性MASH患者巨噬细胞群的空间异质性及其与组织病理学特征的关联，他们利用GeoMx人类全转录组图谱对来自8例“高危”MASH纤维化F3期患者的独立队列的活检样本进行了分析。如果患者同时患有MASH，且纤维化分期至少为2期，并且NAFLD活动评分（NAS）≥4（NAS是脂肪变性、肝细胞气球样变性和小叶炎症组织学评分的总和），则将其归类为“高危”MASH患者。值得注意的是，这些患者具有进一步进展为肝硬化的风险。他们根据特定的组织病理学标准选择感兴趣区域，并使用荧光标记物按顺序分割不同的巨噬细胞（CD68）、免疫细胞（CD45）和上皮细胞[泛角蛋白（panCK）]群（图2a）。他们对总共 80 个片段进行了全转录组图谱 RNA 分析，其中 77 个片段通过了质量控制。主成分分析和层次聚类分析表明，分割后的细胞群根据感兴趣的组织病理学区域进行分组（图2b）。比较实质脂肪性肝炎相关（SH）巨噬细胞与低脂肪变性实质中的库普弗细胞和门脉区（PT）巨噬细胞，他们分别鉴定出 207 个和 348 个差异表达基因（图2c-d）。PT巨噬细胞表现出典型的未成熟/单核细胞表型，缺乏清道夫受体（CD163、CD36、MSR1）的表达，并表达淋巴细胞调节基因（CCL19、CD48、IL7R、CCL5）。与低脂肪变性区域的KC相比，高脂肪变性区域（SH）巨噬细胞同时表现出单核细胞（LSP1和LYZ高表达）和成熟巨噬细胞（MSR1高表达）的特征。值得注意的是，与KC相比，SH巨噬细胞中GPNMB表达升高，同时代谢相关基因（如LPL、FABP5、SPP1和ACP5）的表达也增加（图2c）。虽然GPNMB、LYZ和HLA-DRA等基因在PT和高脂肪变性区域（SH）均高表达，但FABP5、LPL、MSR1和 CD36 的表达更局限于 SH 细胞（图2e）。通路分析显示，与 KC 细胞相比，SH 巨噬细胞中吞噬体呈递基因和抗原呈递基因富集。检测这些 SH 巨噬细胞所在的实质表型，发现肝细胞中气球样变性肝细胞标志物泛素 D和SQSTM1/p62的表达增加，这与组织学结果一致，同时细胞重塑相关基因（例如ANXA2、MSN、KRT8）的表达也增加。此外，与SH区域的细胞相比，PT区域的CD45+CD68−细胞表现出免疫调节基因（如CCL21或TRAF1）的高表达，以及代谢相关基因（如SCD或中性粒细胞相关标志物BRI3）的低表达。为了估计每个感兴趣区域内细胞类型的相对丰度，他们使用从snRNA-seq数据集中提取的细胞谱矩阵，应用了SpatialDecon算法。为了验证分割方法的准确性，他们观察到panCK区域中上皮细胞聚类富集，CD68区域中髓系细胞富集，CD45区域中淋巴细胞亚型富集。此外，他们发现MetMac特征在脂肪性肝炎区域富集，而KC聚类特征主要映射到低脂肪变性区域的CD68片段。单核细胞聚类特征在门脉区和脂肪性肝炎区域均富集。综上所述，这些发现表明，在患有高危MASH的患者中，巨噬细胞基因特征因组织病理学部位而异。

由于GPNMB在snRNA-seq中鉴定为MetMac细胞聚类的主要标志物，并在GeoMx谱分析中显示出显著的差异表达，他们进一步详细表征了GPNMB阳性髓系细胞。对所有细胞聚类中GPNMB阳性细胞的定量分析显示，其在MetMac细胞聚类中的比例最高，在KC、TransMac、前巨噬细胞、单核细胞和cDC2细胞聚类中也有一定比例（图3a-b）。对GPNMB阳性细胞进行无监督聚类分析，划分出五个髓系亚聚类，分别对应于不同的细胞状态（图3c）。

在MetMac细胞群中，LPL和HS3ST2的高表达定义了两个细胞聚类，分别指示甘油三酯水解和硫酸乙酰肝素代谢。其他细胞聚类富集了MARCO和LYZ，反映了KC样和单核细胞样特性（图3c-e）。包括LPL和FABP5在内的细胞聚类标识符以及其他空间分辨的转录本特异性地局限于髓系细胞，而SPP1则在胆管细胞等非髓系细胞中富集。特征图揭示了髓系亚聚类和疾病阶段之间不同的标记动态，表明GPNMB+细胞内存在异质性。为了将GPNMB+细胞群与LAM联系起来，他们应用了最初描述的Trem2相关LAM基因集来计算LAM特征评分。 MetMac 聚类中转录定义的子集，以及 TransMac 聚类中转录定义的子集，在较小程度上表现出 LAM 特征升高（图3d）。

对MASH和非MASH样本中GPNMB+髓系细胞的差异表达分析显示，LPL、FABP5和SPP1的表达增加，同时CD5L和TIMD4的表达下调（图3f），提示随着疾病进展，GPNMB+细胞群的组成发生了变化。为了量化这些变化，他们评估了GPNMB+亚群的相对丰度。GPNMB+细胞占总髓系细胞的比例从非MASH（MASL和正常）的5.7%增加到MASH的12%（图3g）。GPNMB + LPL +和GPNMB + HS3ST2 +亚群分别占髓系细胞的2.8%和4.1%，其中一部分共表达HLA-DRA和CD163（图3g）。在MASH中，TREM2+GPNMB+细胞群仅占0.4%，而GPNMB+LPL+SPP1+细胞群占1%。有趣的是，GPNMB+MARCO+髓系细胞从1.3%下降至0.8%，表明在向MASH进展的过程中，KC样细胞减少（图3g ）。总的来说，这些结果表明GPNMB+细胞群具有高度异质性。在其他公开数据中也观察到了类似的趋势。为了在细胞分辨率下可视化RNA靶标，使用CosMx高通量空间分子成像方法，将包含1000个RNA的复合物与蛋白质分割标记物（CD68、CD45、panCK和一种膜标记物）相结合，对9个MASLD样本和1个正常肝脏样本进行了分析。基于 Louvain 聚类和典型标记的细胞鉴定，可以对主要细胞聚类进行注释，并实现组织学的数字化重建。这突显了从 MASLD 早期到晚期组成复杂性的变化，其特征是实质细胞丢失、结构重塑和免疫细胞浸润（图3f）。分子成像显示，GPNMB+细胞位于实质和门脉区（图3f）。有趣的是，GPNMB+细胞高表达HLA-DRA，并且即使在实质内，其异质性也取决于空间组织学位置。在脂肪肉芽肿和细胞碎片区域，GPNMB+细胞高表达代谢标志物LPL和FABP5（图3h-i）。综上所述，这些结果突显了巨噬细胞在空间上的异质性。

在mRNA水平上进行观察，必须对蛋白质水平进行彻底验证。为此，他们采用了标准免疫组织化学方法以及两种多重蛋白质组学方法——COMET平台和抗体新沉积多重迭代标记（MILAN）。COMET系统提供全自动的顺序多重分析，能够可视化特定感兴趣区域内的蛋白质和mRNA分子；而MILAN系统是一个开放平台，旨在对整个活检样本进行蛋白质多重分析。组织病理学分析包括检查20例活检样本，其中16例为MASLD，4例为对照组（图4a）。值得注意的是，在MASLD中，他们在肝细胞脂肪变性区域和门脉区观察到少量GPNMB免疫阳性细胞。此外，定量分析显示，GPNMB阳性细胞的数量在MASLD终末期逐渐增加。部分细胞胞质内呈现大颗粒状免疫阳性，尤其是在实质细胞丢失区域和门脉区（图4a）。此外，对先前已通过CosMx空间转录组学分析的连续患者样本子集（n  = 6）应用了空间分辨的单细胞蛋白质组学方法COMET。用于蛋白质组多重分析的抗体首先通过标准免疫组织化学方法进行验证，并由肝脏病理专家进行评估。与转录组学结果一致，蛋白质组多重分析揭示了髓系细胞之间存在显著的异质性，CD163、CD48、CD9、GPNMB、HLA-DR、LYZ、S100A4和TREM2以及KC标志物CD5L、MARCO和TIMD4的表达均存在差异（图4b）。对终末期MASLD选定区域内髓系细胞（标记为CD68+、CD163+或CD14+）进行比例分析显示，GPNMB+细胞占18.1%，而反映KC和单核细胞特征的GPNMB+MARCO+和GPNMB +LYZ+细胞分别仅占0.2%和3.8%（图4b）。GPNMB+TREM2+细胞占2.4%，GPNMB+SPP1+细胞占0.5%。此外，CD163+CD5L+MARCO+TIMD4+ KC的数量从组织学正常的活检组织到MASL和MASH逐渐减少。有趣的是，在MASH样本中，与疾病早期阶段相比，CD163+CD5L+MARCO+TIMD4−细胞数量增加，反映了KC细胞群的表型转变。为了进一步研究GPNMB+细胞在MASL进展为MASH过程中的相关性，他们对8个独立的MASLD样本队列应用了多重染色技术MILAN。对整个活检样本进行高维分割，共鉴定出30000个髓系细胞。这些单核细胞/巨噬细胞根据CD68、CD163或CD14的表达进行注释。数字重建显示，根据细胞类型和/或标记物的不同，细胞的空间分布模式也各不相同（图4c）。均匀流形逼近和投影（UMAP）分析显示，GPNMB、LYZ 和 HLA-DR 的表达主要富集于 CD163+细胞中（图4d）。与 MASL 相比，MASH 中 GPNMB+和 HLA-DR+细胞显著增加，同时 CD163+细胞呈减少趋势，而 LYZ+和 SPP1+巨噬细胞的比例保持不变（图4e）。此外，与 MASL 相比，MASH 中 GPNMB+巨噬细胞聚类的 HLA-DR+频率升高，同时 CD163+HLA-DR+双阳性细胞也增加。在门脉区和肝实质中均检测到了独特的 GPNMB+巨噬细胞。空间邻近性分析进一步揭示，9%的GPNMB+巨噬细胞位于胆管细胞10 µm范围内，表明存在门静脉浸润，这与他们更广泛的研究结果一致。总而言之，这些结果突显了MASH进展过程中GPNMB +巨噬细胞群内蛋白质水平的改变，证实了转录组学结果。

随后，他们使用精确切割的肝片（PCLS）作为离体模型来研究GPNMB +巨噬细胞的功能。使用人肝组织制备PCLS，将其培养过夜后，分别用脂质或BSA（对照组）处理24小时（n  =3）。在基线（t  =0 h）时，组织学显示脂肪性肝炎伴散在分布的GPNMB+细胞（图5a）。脂质处理后，GPNMB+细胞在充血的肝细胞区域内形成聚集体，与对照组或基线相比体积增大，连续的苏木精-伊红染色显示类脂褐素巨噬细胞形成增加，表明清除能力增强（图5a）。脂质负荷还诱导了早期脂肪肉芽肿的形成（图5b）。为了评估吞噬活性，他们对终末期MASLD患者的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本进行了GPNMB/组织蛋白酶D（CATD）共染色。高分辨率成像显示GPNMB+和CATD+囊泡广泛共定位，与活跃的吞噬作用相符（图5c）。为了研究微环境如何驱动MASH中的巨噬细胞功能，重点关注IL-32，在snRNA-seq和GeoMx数据集中均发现IL-32在MASH样本的肝细胞中差异表达。值得注意的是，既往研究报道重症MASLD患者的肝脏IL-32水平升高。CosMx空间分析证实了终末期MASLD患者肝细胞中IL - 32的强表达（图5d ）。这些空间关联性通过彗星多重染色法在连续切片上得到验证，该方法结合了IL32 mRNA探针和GPNMB抗体染色（图5e）。在活检样本中，随着疾病进展， IL32+肝细胞和GPNMB+巨噬细胞逐渐增多，尤其是在早期阶段的门脉区和门周区。此外，在富含气球样变性肝细胞的区域， IL32表达升高，这些区域以视黄醇代谢酶AKR1B10为标志（图5f）。为了在体外验证这些发现，将分化的THP-1髓系细胞与白细胞介素（IL）4、IL32、视黄醇或脂多糖一起培养24小时，同时用油酸和棕榈酸（PA）进行脂质加载（图5g）。值得注意的是，与其他条件相比，IL32 处理的细胞在 24 小时后表现出增强的游离脂质颗粒的吞噬摄取（图5h），同时伴有细胞质 MSR1 和 GPNMB 囊泡形成增加/增大（图5h-g）。此外，IL-32 处理可剂量依赖性地刺激内溶酶体降解活性（图5i）。特别是，先前已有报道称 PA 可诱导肝巨噬细胞产生促炎反应。体外实验数据表明，用 IL-32 处理 THP-1 细胞可增强 PA 诱导的促炎细胞因子IL-1β的表达，同时降低抗炎标志物IL-10的表达（图5j）。综上所述，这些结果强调了肝细胞来源的 IL-32 在维持 GPNMB+巨噬细胞的吞噬能力和调节其促炎反应中的关键作用，并将肝细胞信号传导与巨噬细胞功能在 MASH 进展中联系起来。

为了解巨噬细胞异质性的临床意义，他们对各种组学数据集中的标记物表达进行了广泛的分析——包括来自特征明确的 206 例 MASLD 患者和 10 例对照者的转录组学数据、来自 247 例经活检证实的 MASLD 患者的血清 SomaLogic 蛋白质组学数据，以及基于来自英国生物银行 (UKB) 大型队列（53030 名参与者）的 OLINK 蛋白质组学数据的表型组关联研究 (PheWAS) 分析。分析与空间转录组学相关的选定基因的表达时，在 MASL 和 MASH 之间观察到了明显的分割，这些基因包括GPNMB、LYZ、LPL、HLA-DRA、HLA-DRB1、FABP5和LSP1（图6a）。与门静脉巨噬细胞表型相关的标志物（例如CCL19和CLEC10A）在晚期 MASLD 中表达更高，而CD163表达降低。肝细胞标志物 AKR1B10 和 IL32 随疾病进展逐渐升高。利用 snRNA-seq 数据对整体 RNA-seq 数据进行反卷积并估计髓系细胞比例，结果显示，代谢型巨噬细胞 (MetMacs) 和单核细胞的比例随疾病进展显著增加，而KC的比例逐渐降低（图6b）。在评估纤维化分期和组织学 MASLD 活动评分（脂肪变性、肝细胞气球样变性和小叶炎症评分之和）时，也观察到了类似的趋势。为了探讨巨噬细胞标志物在预测疾病活动性方面的应用价值，他们进行了逻辑回归分析。转录组学队列的复合模型将临床变量“年龄”以及ACP5、CD163、LPL和MSR1的表达水平确定为独立变量，用于区分疾病活动度高的患者。在该模型中，LPL表达水平发挥了重要作用。功能上，与对照组相比，使用THP-1细胞系进行LPL CRISPR-Cas9敲除后，在脂质加载24小时后，细胞呈现泡沫巨噬细胞表型。接下来，他们研究了肝脏变化是否与循环蛋白的系统性改变相关。利用经活检证实的MASLD患者的血清蛋白质组学数据，他们根据是否存在“高危”MASH、晚期纤维化、是否存在MASH或疾病活动度高（NAS≥4）对个体进行分层。循环标志物中最显著的变化见于可溶性CD163、GPNMB和MSR1（图6c-d）。PheWAS分析涵盖了53030名参与者的大型队列，结果显示可溶性GPNMB与代谢综合征的特征（特别是糖尿病和低血糖）密切相关，而CD163与糖尿病和慢性肝病显著相关。综上所述，综合分析揭示了MASLD中巨噬细胞异质性、疾病进展和循环蛋白动态之间错综复杂的相互作用。

本研究通过整合多组学技术，对人类样本进行分析，阐明了MASLD疾病谱中肝脏巨噬细胞的演变图谱，揭示了库普弗细胞的逐渐减少，同时出现了多种表型不同的巨噬细胞亚群。空间多组学进一步表明，疾病进展至MASH的标志是抗原呈递、吞噬性GPNMB+巨噬细胞的积累，这些巨噬细胞由产生IL-32的肝细胞支持。这些巨噬细胞表现出适应性的代谢和促炎表型，这种表型受到空间环境和疾病阶段的严格调控。已鉴定的巨噬细胞标志物能够根据疾病活动度和分期对不同临床队列中的患者进行分层。本研究揭示了MASLD进展过程中巨噬细胞类型和代谢适应表型的多样性。