文献解读|Adv Sci（14.3）：乳腺导管癌的蛋白质组学图谱揭示肿瘤进展特征和治疗靶点

乳腺癌 (BC) 是女性最常见的癌症之一，其形态、分子表达谱和临床病程具有高度异质性。乳腺导管癌 (BRDC) 是 BC 最常见的类型，具有独特的临床和病理特征。组织病理学上，人 BRDC 的经典进展模型是一个线性多步骤过程，始于导管增生 (DH)，进展为导管原位癌 (DCIS)，并演变为浸润性导管癌 (IDC)。根据组织病理学标准[包括激素受体（雌激素受体和/或孕激素受体）和/或人表皮生长因子受体 2 (HER2) 的表达]，IDC 分为四种主要临床亚型：管腔 A、管腔 B、HER2 富集型和 TNBC。

本研究共收集了 168 名患有恶性和良性乳腺疾病且未接受过治疗的女性患者的 224 个样本。随后，三位专家病理学家将本研究队列中的 224 个样本分为 4 个进展阶段，包括正常导管上皮组织(Normal)、导管增生(DH)、导管原位癌(DCIS)和浸润性导管癌(IDC)。DH 样本包括正常导管增生(UDH)和非典型导管增生(ADH)。

用基于质谱 (MS) 的非标记定量策略对 224 个样本进行了蛋白质组学分析，使用 Fe-NTA 富集策略对 49 个样本进行了磷酸化蛋白质组学分析，并对 79 个样本进行了全外显子组测序 (WES)，以检测癌症基因组中任何可能的遗传变异。此外，还对 42 个样本进行了 转录组分析(RNA-seq)，本研究在多组学水平上揭示了 BRDC 的进展特征（图1A）。

WES 数据导致平均靶标覆盖率为 131.1 倍，并鉴定出 14885 个遗传变异事件。他们鉴定了 18 个高频突变（TP53、PIK3CA、KMT2D、FAT3、ARID1A、GATA3、PREX2、APC、ERBB2、FAT1、CDH1、NOTCH2、PTEN、BRCA2、CIC、MAP3K1、AKT1和AKAP9）（图 1C）。值得注意的是，整个队列中TP53基因的突变频率为 34%，显著突变始于 DCIS 期（图 1C）。与Pareja的DCIS队列相比，本研究的DCIS队列中的高频突变与Pareja队列几乎一致（图 1D）。与Jiang的IDC队列相比，本研究的IDC队列中已知的BC高频突变与Jiang的IDC队列几乎一致（图 1E）。这些结果进一步证明本研究中的基因组测序数据的可靠性。

为了阐明DH进展为DCIS的第一步，他们研究了BRDC进展中的新突变，发现TP53突变是BRDC的高频事件，并且早在肿瘤发生阶段就发生了突变，在DCIS中发生的频率为50％，而在DH中没有观察到TP53突变（图 1C，图2A）。其次， TP53突变组TP53表达量显著高于TP53野生型组（图 2B）。一致地，DCIS中TP53的表达量显著高于DH（图 2B）。进一步的基因集富集分析(GSEA)显示，与TP53野生型组相比， TP53突变组的胆固醇稳态通路显著富集（图 2C）。此外，相关性分析结果显示，胆固醇稳态通路的富集评分与TP53的表达呈显著正相关（图 2D）。基于单样本基因集变异分析 (ssGSEA)的通路评分表明，与野生型TP53组和 DH 相比， TP53突变组和 DCIS中的胆固醇稳态通路显著上调（图 2E）。综上所述，这些结果表明突变型 TP53 可能参与调节胆固醇稳态。

先前的研究表明，多个基因可以特异性地与突变的TP53结合并参与调控恶性表型。进一步，他们收集了一组与突变型TP53形成复合物的蛋白质，其中固醇调节元件结合转录因子2 (SREBF2)的表达在TP53突变组中显著高于TP53野生型组（图 2F）。基于RNA-seq数据推断TP53突变组和DCIS中SREBF2的转录活性。结果表明，TP53突变组和DCIS中SREBF2的转录活性高于野生型TP53组和DH（图 2G）。GSEA显示胆固醇稳态通路在TP53突变组和DCIS中富集（图 2H）。从另一个角度，他们分析了特定转录因子(TF)与靶基因(TG)之间的关系，以及它们在BRDC进展过程中的动态变化。值得一提的是，DCIS的特异性TF，如固醇调节元件结合转录因子1 (SREBF1)，SREBF2和雌激素受体1 (ESR1)主要参与类固醇代谢过程。与野生型TP53组和DH相比，胆固醇生物合成相关蛋白[羊毛甾醇合酶(LSS)，固醇-C5-去饱和酶(SC5D)和甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(MVD)]在TP53突变组和DCIS中在mRNA和蛋白质水平上均上调（图 2I-J）。这些结果表明突变型TP53与SREBF2共同参与DCIS中胆固醇稳态的调节。

细胞内胆固醇水平反映了胆固醇合成、运输和酯化之间的动态平衡。相关性分析结果显示，SREBF2与类固醇激素生物合成富集评分呈显著正相关，提示在DCIS中合成的胆固醇可能代谢为类固醇激素（图 2K）。在TP53突变组和DCIS 中雌激素合成相关蛋白上调（图2L）。这些结果提示，细胞内胆固醇可能通过StAR相关脂质转移结构域3 (STARD3)转运至线粒体，代谢为雌激素（图 2L）。在6种类固醇激素受体[雌激素受体1(ESR1)、雌激素受体2(ESR2)、雄激素受体(AR)、孕激素受体(PGR)、核受体亚家族3组C成员1(NR3C1)和核受体亚家族3组C成员2(NR3C2)中，仅TP53突变组和DCIS的ESR1活性和表达水平高于TP53野生型组和DH（图 2M）。为了进一步评估转录因子ESR1在DCIS中的作用，他们结合了来自CHEA转录因子靶标数据集，在TP53野生型组和DCIS中，细胞增殖相关通路均上调（图 2N）。TP53突变组和DCIS的多基因增殖评分(MGPS)显著高于TP53野生型组和DH。此外，他们通过免疫组织化学 (IHC) 检查了本研究队列中突变型 TP53 和 ESR1 的表达水平，证实 DCIS 中突变型 TP53 和 ESR1 的表达高于 DH（图2O）。

为了验证SREBF2是否参与胆固醇合成并进而调控ESR1的表达，他们利用针对SRBEF2的siRNA敲低MCF10DCIS.COM细胞中SRBEF2的表达，通过mRNA和蛋白表达水平验证 SRBEF2敲低细胞的有效性（图2P-Q）。接下来他们检测了胆固醇合成基因（LSS、SC5D和MVD）的转录水平。结果显示，与野生型MCF10DCIS.COM细胞相比， SRBEF2敲低的MCF10DCIS.COM细胞中胆固醇合成相关蛋白（LSS、SC5D和MVD）的转录水平显著下调（图 2Q）。为了验证SREBF2敲低对胆固醇及其下游雌激素合成水平的影响，他们通过ELISA检测了SRBEF2敲低的MCF10DCIS.COM细胞中胆固醇及其下游雌激素的合成水平。在SREBF2敲低后，MCF10DCIS.COM细胞中胆固醇及其下游雌激素的合成水平降低（图 2R-S）。这些结果提示，SREBF2参与了胆固醇及其下游雌激素的合成。据报道，雌激素可以增强ESR1的表达。与野生型MCF10DCIS.COM细胞相比，SRBEF2敲低的MCF10DCIS.COM细胞中ESR1的表达水平显著下调（图2T）。此外，与野生型MCF10DCIS.COM细胞相比，他们发现SRBEF2敲低的MCF10DCIS.COM细胞的细胞增殖受到明显抑制（图 2U），这些结果进一步证明SRBEF2的激活导致胆固醇合成基因增多，进而引起ESR1的上调，进而促进细胞增殖。综上所述，这些结果表明TP53突变增加 ESR1 活性和表达，进一步促进细胞增殖，导致致癌作用（图 2V）。

结合组织病理学信息，他们将队列中的 73 个 DCIS 样本分为两个亚组：DCIS_Pure（纯 DCIS）和 DCIS_adjIDC（毗邻 IDC 的 DCIS，侵袭性癌症的 DCIS 区域）。基于蛋白质组学数据研究了队列中的肿瘤微环境成分。值得注意的是，DCIS_Pure 显示出最低的免疫评分（图 3A）。在 DCIS_Pure 中，CD8+ Tem、CD8+ Tcm 和 CD8+ T 细胞的丰度处于最低水平，这与 CD8+ T 细胞标志物 CD8A 的表达水平一致（图 3B）。蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析表明，与DH、DCIS和IDC相比，正常组中炎症反应相关通路显著上调（图 3B ）。此外，他们发现DCIS_Pure中免疫相关通路下调，包括细胞因子-细胞因子受体相互作用、T细胞受体信号转导、B细胞受体信号转导和JAK-STAT信号转导（图 3B）。这些结果表明 DCIS_Pure 在 BRDC 进展中处于免疫静止阶段。

相反，类固醇激素受体NR3C1在mRNA和蛋白质水平上都达到峰值（图 3B-C）。据报道，NR3C1是炎症的重要下调因子。值得注意的是，NR3C1的表达与免疫评分之间存在显著的负相关性，这表明NR3C1可能参与DCIS_Pure中的免疫静止。NR3C1的总共5个TF（IRF3、PRDM1、SRF、TCF3和GATA6）在其蛋白质表达水平和拷贝数改变(CNA)之间显示出顺式效应（图 3D）。其中，他们在6q21上鉴定出一个PR-domain containing 1(PRDM1)的顺式效应，且其在DCIS_Pure中的蛋白表达水平高于DH（图 3D-E）。此外，他们发现NR3C1与PRDM1的蛋白表达之间存在显著的正相关性（图 3E）。

转录活性分析表明，核因子κB亚基1(NF κ B1)和核因子NF-κB P65亚基(RelA)在TNF- α信号通过NF-κB通路中的转录活性在DCIS_Pure中显著降低（图 3F）。NF κ B1和RelA复合物的转录活性评分与免疫评分和细胞因子-细胞因子受体相互作用通路的富集评分呈显著正相关性（图 3G）。细胞因子 CXC 基序趋化因子配体 12（CXCL12）和 C-X3-C 基序趋化因子配体 1（CX3CL1），NF κ B1 和 RelA 的 TG，在 DCIS_Pure 中的 mRNA 和蛋白质水平上均显著下调（图 3H）。先前的研究报告称，CXCL12 和 CX3CL1 可以影响 CD8+ T 细胞。在本研究的蛋白质组学数据中，CXCL12 和 CX3CL1 与 CD8 亚基 alpha (CD8A)显著正相关（图 3I），并且 CD8A 在 DCIS_Pure 中下调（图 3B）。

有趣的是，他们观察到DH和DCIS_adjIDC的免疫评分高于DCIS_Pure，提示DCIS_Pure中存在免疫逃逸，而DCIS_adjIDC中存在免疫激活（图 3A）。为了探究DCIS_adjIDC中免疫激活的原因，他们进行了顺式效应分析，发现PPARD是顺式效应基因，导致PPARD编码的蛋白质（过氧化物酶体增殖激活受体δ：PPARD）在DCIS_adjIDC中上调，转录因子PPARD参与免疫调控。

另一方面，IHC证明DCIS_Pure中CD8+ T细胞的丰度低于DH和DCIS_adjIDC，而NR3C1的表达水平在DCIS_Pure中高于DH和DCIS_adjIDC（图 3J）。综上所述，从DH到DCIS_Pure，6q21增益增加了PRDM1的表达并进一步上调NR3C1的表达，通过抑制NF κB介导的TNF- α信号通路导致CX3CL1和CXCL12的表达下调。CX3CL1和CXCL12的下调表达导致它们对CD8+ T细胞的趋化作用降低，从而导致DCIS_Pure中肿瘤细胞的免疫逃逸（图 3K）。

为了验证PRDM1是否调控NR3C1的表达，他们利用针对PRDM1的siRNA敲低MCF10DCIS.COM细胞中PRDM1的表达，通过mRNA和蛋白表达水平验证PRDM1敲低细胞的有效性（图 4A-B）。为了验证PRDM1是否调控NR3C1的表达，他们检测了NR3C1的表达水平，发现PRDM1敲低后NR3C1的表达水平显著降低（图 4B），这些结果说明PRDM1敲低降低了NR3C1的表达水平。接下来，为了验证PRDM1敲低对CX3CL1和CXCL12水平表达的影响，他们检测了CX3CL1和CXCL12的转录水平和蛋白表达水平。上述结果显示，与野生型MCF10DCIS.COM细胞相比，PRDM1敲低的MCF10DCIS.COM细胞中CX3CL1和CXCL12的转录水平和蛋白表达均显著上调（图 4C-F）。此外，他们检测了PRDM1敲低的MCF10DCIS.COM细胞中CX3CL1和CXCL12的释放水平，发现PRDM1敲低后，培养基(CM)中CX3CL1和CXCL12的表达水平增加（图 4G-H）。

为了验证NR3C1通过抑制NF-κB介导的TNF-α信号通路来调控CX3CL1和CXCL12的下调表达，他们利用针对NR3C1的siRNA来敲低MCF10DCIS.COM细胞中NR3C1的表达。在mRNA和蛋白质水平上验证了 NR3C1敲低细胞的效果（图4I-J）。此外，在用NF-κB抑制剂BAY 11-7082 (10 µm)处理后，NF-κB信号通路发生下调，如p65磷酸化水平所示(图 4K )。接下来，他们检测了CX3CL1和CXCL12的转录水平和蛋白质表达水平。上述结果显示，与野生型MCF10DCIS.COM细胞相比，NR3C1敲低的MCF10DCIS.COM细胞中CX3CL1和CXCL12的转录水平和蛋白表达水平显著上调（图 4L-O）。然而，用BAY 11-7082 (10 µm)处理NR3C1敲低的MCF10DCIS.COM细胞后，CX3CL1和CXCL12的转录水平和蛋白表达水平显著下调，这表明NR3C1敲低引起的CX3CL1和CXCL12的上调趋势由BAY 11-7082抑制（图 4L-O）。此外，他们检测到了NR3C1敲低的MCF10DCIS.COM细胞中CX3CL1和CXCL12的释放水平。在NR3C1敲低后CM中CX3CL1和CXCL12的表达水平增加（图4P-Q）。然而，在用BAY 11-7082 (10 µm) 处理NR3C1敲低的MCF10DCIS.COM细胞后的CM中，其CX3CL1和CXCL12的释放水平降低（图 4P-Q）。这些结果进一步证实NR3C1通过抑制NF-κB介导的TNF-α信号通路来下调CX3CL1和CXCL12的表达水平。

此外，之前研究还报道 CXCL12 和 CX3CL1 能够趋化 CD8+ T 细胞。在本研究的蛋白质组学数据中，CXCL12 和 CX3CL1与CD8A 呈显著正相关，这表明 CXCL12 和 CX3CL1 可能具有趋化 CD8+ T 细胞的能力。为了进一步验证上述假设，他们从 BC 患者的外周血单个核细胞(PBMC)中分离 CD8+ T 细胞。通过流式细胞技术检测分离的 CD8+ T 细胞的纯度（图 4R）。然后，他们进行了双室 CD8+ T 细胞迁移试验。与野生型 MCF10DCIS.COM 细胞的 CM 相比，NR3C1敲低的 MCF10DCIS.COM 细胞的CM 存在更多的 CD8+ T 细胞（图 4S）。这些结果进一步证实了CX3CL1和CXCL12的表达下调导致其对CD8 + T细胞的趋化性降低，从而导致DCIS_Pure中肿瘤细胞的免疫逃逸。

为了进一步研究DCIS_adjIDC如何具备侵袭能力并发展为IDC，他们筛选了DCIS_Pure与DCIS_adjIDC之间的差异表达分子（图 5A）。差异表达分子的通路富集分析显示，DCIS_adjIDC中富集的分子主要参与类固醇激素生物合成、O-聚糖生物合成、RHO GTP酶循环、HIF-1信号通路；DCIS_Pure富集的分子主要参与缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸降解、磷酸五糖、补体和凝血级联、黏着斑的调节（图 5A）。

为了确定 DCIS_Pure 和 DCIS_adjIDC 中基因组驱动因素的差异，他们比较了它们之间的基因组变异差异。多个染色体增益事件（例如染色体 21q22.11 和 4p16.1增益）在 DCIS_adjIDC中比在 DCIS_Pure中更频繁（图 5A）。21q22.11 中的 T 细胞淋巴瘤侵袭和转移 1 (TIAM1)，具有显著正向顺式效应，在 DCIS_adjIDC 中上调（图 5A）。此外，在 CPTAC BC 队列中，TIAM1 在 mRNA 和蛋白质水平上也分别观察到显著正向顺式效应。TIAM1编码一种大蛋白，可作为 Rho GTPases 或 Rho 样 GTPases 的 GDP 到 GTP 交换因子，例如 RAC 家族小 GTPase 1 (RAC1)、RAC 家族小 GTPase 2 (RAC2)、RAC 家族小 GTPase 3 (RAC3)、RAS 同源物家族成员 A (RHOA) 和细胞分裂周期 42 (CDC42)。其中，RAC 家族成员在 DCIS_adjIDC 中上调，而 RHOA 和 CDC42 在 DCIS_Pure 中上调（图 5B）。TIAM1 的表达水平与 RAC3 的表达水平呈显著正相关性，但与 RAC1和 RAC2无关（图 5B-C）。

值得注意的是，RAC3的表达水平与类固醇激素生物合成通路的评分呈显著正相关（图 5D），并且类固醇激素生物合成途径在DCIS_adjIDC中上调。相应地，与DCIS_Pure相比，在6种类固醇激素受体中，只有AR的蛋白表达水平在DCIS_adjIDC中上调（图 5E），并且DCIS_adjIDC中AR的转录活性高于DCIS_Pure。此外，据报道，LIM激酶1 (LIMK1) 是Rho GTPases的特征下游效应物，并参与AR核易位。进一步研究发现，RAC3与LIMK1表达相关性为0.57，LIMK1与AR表达相关性为0.59（图 5F）。这些结果提示，激活的RAC3可能通过LIMK1促进AR的核转位。

他们进一步筛选了AR的靶基因，发现醛酮还原酶家族1成员C1 (AKR1C1) 在DCIS_adjIDC中mRNA和蛋白质水平均显著上调（图 5G）。据报道，AKR1C1参与调控活性氧(ROS)代谢过程。随后他们发现AKR1C1的表达水平与ROS通路评分呈显著负相关，在DCIS_adjIDC中ROS通路评分显著降低（图 5H），提示AKR1C1可以清除DCIS_adjIDC细胞中过量的ROS（图 5H）。清除细胞内过多的ROS可阻止肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞迁移和侵袭。令人惊讶的是，与DCIS_Pure相比，DCIS_adjIDC中的凋亡通路显著下调（图 5I-J）。此外，在人乳腺癌细胞HCC1806中敲低AKR1C1后，凋亡信号通路显著上调（图 5K-L），ROS的平均荧光强度(MFI)显著增加（图 5M）。另一方面，这与以前的报道一致，即ROS可能通过诱导缺氧诱导因子1α (HIF-1α) 诱导DCIS_adjIDC细胞侵袭和迁移，导致血管内皮生长因子 (VEGF) 上调，并抑制组织金属蛋白酶抑制剂1 (TIMP1)，导致基质金属肽酶 (MMP) 上调（图 5N-O）。此外，IHC结果显示DCIS_adjIDC中TIAM1、AR和AKR1C1的表达高于DCIS_Pure（图 5P）。总体而言，这些结果表明 TIAM1-AR-AKR1C1 轴促进 DCIS_adjIDC 中的细胞侵袭和迁移（图5Q）。

为了系统地验证TIAM1-AR-AKR1C1轴在BC中的作用和机制，他们进行了一系列实验研究。首先，为了验证TIAM1对细胞迁移和凋亡的影响，他们利用针对TIAM1的siRNA来敲低HCC1806中TIAM1的表达。通过mRNA和蛋白质表达水平验证TIAM1敲低细胞的有效性（图 6A）。接下来，他们对HCC1806或TIAM1敲低的细胞进行了细胞凋亡和迁移实验。与用 siRNA 处理的 HCC1806 相比，TIAM1敲低显著促进了细胞凋亡（图6B）。此外，他们通过 CCK-8 法检测了 TIAM1 敲低是否影响乳腺癌细胞 HCC1806 的生长。TIAM1敲低抑制了 HCC1806 细胞的增殖（图 6C）。此外，通过伤口愈合实验检测了HCC1806 或TIAM1敲低后的细胞的迁移能力。与 siRNA 处理的 HCC1806 相比， TIAM1敲低减少了细胞的迁移距离（图 6D）。综上所述，TIAM1 促进肿瘤细胞的迁移并抑制细胞凋亡。

进一步为了研究TIAM1是否通过AR核转位-AKR1C1 TF-TG对来影响细胞迁移和凋亡，他们提取了TIAM1敲低的HCC1806细胞的核蛋白，并检测了核蛋白AR的表达水平。TIAM1敲低后，细胞核中AR的表达水平显著降低（图 6E）。此外，他们进行免疫荧光观察发现在野生型HCC1806细胞中AR均匀分布于细胞核和细胞质中（图 6F），然而在TIAM1敲低的HCC1806细胞中AR与细胞核之间几乎没有共定位（图 6F）。与野生型HCC1806细胞相比，TIAM1敲低的HCC1086细胞中的转录水平显著降低（图6G）。这些结果表明TIAM1敲低抑制了 AR 核转位，并降低了 AKR1C1 的转录水平。然后，为了验证 AR 核转位在 AKR1C1 表达和 BC 进展中的作用，他们用 AR 核转位激活剂 5α-双氢睾酮 (5α-DHT) 处理 HCC1806 细胞。为了证明 5α-DHT 对 AR 核转位的影响，他们进行免疫荧光检查并观察到 5α-DHT（0.1 µm和1 µm）处理后 HCC1806 细胞中 AR 与细胞核之间更多的共定位。这些结果表明 5α-DHT 促进了 HCC1806 细胞中的 AR 核转位。然后，他们进行了细胞迁移试验并检测了 5α-DHT 处理后 AKR1C1 的表达水平。结果表明0.1μm和1μm 5α-DHT均可显著提高AKR1C1在mRNA和蛋白质水平的表达水平（图 6H-I）。此外，伤口愈合实验进一步显示0.1μm和1μm 5α-DHT均促进HCC1806细胞的迁移（图 6J）。综合以上结果，提示TIAM1促进AR核转位，进而调控AKR1C1的转录，可能引起细胞迁移。

接下来，为了确认 AKR1C1 在 BC 中的作用，他们选择了两种 AKR1C1 表达差异的人类 BC 细胞系 HCC1806 和 HCC1937 进行进一步研究（图 6K-L）。值得注意的是，过表达 AKR1C1 的细胞的迁移能力提高了（图 6M）。相反，使用针对AKR1C1的 siRNA来敲低 HCC1806 中 AKR1C1 的表达，通过蛋白表达情况验证AKR1C1敲低的效果（图 6N）。为了证明AKR1C1对细胞凋亡的影响，他们通过免疫印迹法检测了凋亡相关分子的表达。与siRNA处理的细胞相比，AKR1C1敲低的HCC1806细胞中凋亡相关分子caspase 3和caspase 8的表达水平显著升高（图 6N）。结果提示AKR1C1可以抑制细胞凋亡。此外，为了证明AKR1C1对细胞迁移的影响，通过伤口愈合和transwell实验检测了AKR1C1缺陷后HCC1806的细胞迁移能力。敲低AKR1C1显著减少了细胞迁移距离（图 6O）。这些结果表明 AKR1C1 促进细胞迁移。他们通过在TIAM1敲低的 HCC1806 细胞中过表达 AKR1C1 进行了挽救实验（图 6P）。值得注意的是，在TIAM1敲低的 HCC1806 细胞中过表达 AKR1C1 可有效逆转TIAM1沉默对细胞凋亡和迁移的影响（图6Q-R）。以上结果提示TIAM1促进AKR1C1的表达，从而加速HCC1806细胞的迁移并抑制其凋亡。

此外，基于 TIAM1-AR-AKR1C1 轴在乳腺癌进展中的作用，他们确定了靶向 AKR1C1 在体外治疗乳腺癌的潜在治疗效果。众所周知的水杨酸类药物阿司匹林可以抑制 AKR1C1 的活性。为了验证阿司匹林靶向 AKR1C1 对乳腺癌的潜在治疗作用，他们用最低有效剂量阿司匹林(0.5 mM)处理 HCC1806 细胞（图 6S）。结果表明，阿司匹林可以抑制细胞生长，并减少 HCC1806 的迁移距离（图 6T）。他们进一步采用了一种更有效的针对 AKR1C1 的 BC 抑制剂地屈孕酮来处理 HCC1806。结果显示，最低有效剂量的地屈孕酮 (10 µm) 显著抑制了 HCC1806 的细胞生长和细胞迁移（图 6U-V）。此外，10 µm 地屈孕酮对AKR1C1过表达的 HCC1937 细胞生长的抑制作用比野生型 HCC1937 更明显（图6W-X）。总之，这些结果揭示了 AKR1C1 在促进肿瘤细胞迁移和抑制细胞凋亡方面的作用，并且这种作用可以通过抑制剂来缓解。

目前，乳腺癌的多组学研究主要集中在IDC分期。根据ER、PR、HER2和（增殖标志蛋白KI67）KI67的表达情况，IDC分为四种主要临床亚型：管腔A、管腔B、HER2富集型和TNBC。为了说明四种IDC临床亚型的蛋白质组学特点，他们比较了四种IDC临床亚型之间的差异，分别鉴定了在管腔 A、管腔 B、HER2 富集和 TNBC 样本中显著过表达的 52、64、157 和 132 种蛋白质（图 7A）。使用 ConsensusPathDB 和 DAVID 数据库对富集蛋白进行聚类和聚类特异性富集分析，显示管腔 A、管腔 B、HER2 富集和 TNBC 样本中所代表的不同生物学过程和通路（图 7A）。具体而言，IDC-管腔 A 以能量代谢改变为特征。 IDC-管腔B 的特点是雌激素信号传导（即 ESR1 和 PR）和 mTOR 信号传导改变。IDC-HER2富集亚型与粘着斑和葡萄糖稳态相关。TNBC 与细胞周期、VEGF 信号通路、、TNF 信号传导和免疫相关通路改变。

为了阐明DCIS如何进展为不同亚型的IDC，他们通过GSEA对四种临床亚型的IDC和配对的DCIS_adjIDC样本进行了成对比较。DCIS_adjIDC样本相应地分为pre-管腔A、pre-管腔B、pre-HER2富集和pre-TNBC。GSEA 显示，与pre-管腔 A 相比，雌激素反应（例如 FHL2、AQP3、GFRA1、PODXL 等）、氧化磷酸化 (OXPHOS)（例如 ATP5PO、NDUFS7、COX6C、NDUFB1、ACAA1 等）和 TCA 循环（例如 IDH3B、DLST、SUCLA2 和 IDH3G）在 IDC-管腔 A 中上调（图7B）。与pre-管腔B相比，IDC-管腔B中的雌激素反应（例如PGR、SLC1A4、MUC1、WFS1、AQP3等）、OXPHOS（例如NDUFS7、COX6C、IDH3B、SUCLG1、ACAT1等）和脂肪酸代谢（例如SUCLG1、CA4、ADH7、CBR1、GRHPR等）均上调。与pre-HER2富集相比，IDC-HER2富集组中糖酵解（如PKM、CHPF2、ME2、SPAG4、STMN1等）和缺氧（如BHLHE40、SERPINE1、EXT1、SLC37A4、KIF5A等）上调。与TNBC前相比，IDC-TNBC中IL2-STAT5信号（如BCL2L1、TLR7、MUC1、PTH1R、CD48等）上调（图 7B-C）。这些数据提示，在DCIS向IDC的转变过程中，IDC-管腔 A定义为“需氧及TCA型”，IDC-管腔B定义为“需氧及脂肪酸代谢型”，IDC-HER2富集亚型定义为“缺氧及糖酵解型”，IDC-TNBC定义为“免疫型”。

为了验证从DCIS到IDC临床亚型的进展路径，他们选择了四种人乳腺癌细胞系[包括T47D（IDC-管腔A，HR+/HER2-）、BT-474（IDC-管腔B，HR+/HER2+）、SKBR-3（IDC-HER2-富集，HR-/HER2+）和MDA-MB-231（IDC-TNBC，HR-/HER2-），以更好地模拟在蛋白质组学数据中鉴定的IDC亚型模式。通过分析氧消耗率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)，他们证实了两种管腔亚型细胞系T47D和BT-474比SKBR-3表现出更强的有氧活性，而SKBR-3表现出更强的糖酵解活性（图 7D-E），证明IDC-管腔亚型为“需氧型”，IDC-HER2富集型为“糖酵解型”的特点。

蛋白质组学数据显示，与pre-管腔亚型相比，OXPHOS和雌激素反应途径在IDC-管腔亚型中上调（图 7C）。为了靶向OXPHOS通路，IACS-010759作为临床级线粒体OXPHOS复合物I的小分子抑制剂，用于处理乳腺癌细胞。IACS-010759 (1μm)对T47D和BT-474细胞的抑制效果优于SKBR-3细胞（图 7F）。IACS-010759和雌激素受体抑制剂他莫昔芬联合使用，对T47D细胞的细胞活力的抑制效果优于单独使用他莫昔芬（图 7G）。此外，与pre-管腔A相比，IDC-管腔A中TCA循环通路上调（图 7C）。前期研究表明，TCA循环通路中的酰基辅酶A合成酶短链家族成员2(ACSS2)可能在低氧和缺脂条件下促进癌细胞生长。他们证实了ACSS2在T47D细胞中有高表达（图 7H）。用siRNA敲低ACSS2可抑制T47D细胞生长，而使用IACS-010759 (1μm)对siACSS2细胞的抑制效果更显著（图 7I）。

蛋白质组学数据显示，与pre-管腔B相比，IDC-管腔B中的脂肪酸氧化活性相对较高（图 7C）。正如预期的那样，在含有13C标记棕榈酸的培养基中培养的BT-474细胞中13C标记的乙酰辅酶A的形成最高（图 7J），这表明脂肪酸氧化活性在BT-474细胞中更高。为了靶向脂肪酸氧化通路，他们将etomixir (50µm)用作肉碱棕榈酰转移酶-1（CPT-1，脂肪酸氧化限速酶）抑制剂来处理乳腺癌细胞，它抑制了BT-474细胞的生长，但没有抑制SKBR-3细胞的生长（图 7K）。拉帕替尼作为HER2的小分子抑制剂，已用于治疗HER阳性乳腺癌患者。此外，他们发现Etomixir (50 µm)和拉帕替尼联合使用比单独使用拉帕替尼显著降低了 BT-474 细胞的细胞活力（图 7L）。

蛋白质组学数据显示，与pre-HER2富集相比，IDC-HER2富集的缺氧通路上调（图 7C）。针对缺氧通路，使用HIF-1α抑制剂px-478 (20 µm)处理乳腺癌细胞，抑制了SKBR-3细胞数量，但没有抑制管腔亚型细胞系（图 7M）。px-478 (20 µm)和拉帕替尼联合使用对SKBR-3细胞的抑制效果优于单独使用拉帕替尼（图 7N）。

蛋白质组学数据显示，与 pre-TNBC 亚型相比，IL2-STAT5 信号在 IDC-TNBC 中上调。为了研究针对 TNBC 乳腺癌细胞的 IL-2-STAT5 通路的潜力，他们用 IL-2 抑制剂 IL-2-IN-1 处理 MDA-MB-231 细胞。用 20 µm IL-2-IN-1 处理的 MDA-MB-231 细胞的生长受到显著抑制（图 7O）。这些结果表明 IL-2-IN-1 有可能成为抑制 TNBC 乳腺癌细胞的治疗剂。

综上所述，他们发现 IACS-010759 对 T47D 细胞的抑制作用优于对 BT-474 细胞和 SKBR-3 细胞的抑制作用。IACS-010759 作为管腔 A 型乳腺癌细胞的潜在治疗剂，与他莫昔芬联合使用对这些细胞表现出更好的抑制作用。此外，Etomixir 对 BT-474 细胞的抑制作用优于对 T47D 细胞和 SKBR-3 细胞的抑制作用。Etomixir 显示出作为抑制管腔 B 型乳腺癌细胞的治疗剂的潜力，与拉帕替尼联合使用可产生更好的抑制效果。px-478 显示出作为抑制 HER2 富集乳腺癌细胞的治疗剂的前景，与拉帕替尼联合使用在这方面更有效。最后，IL-2-IN-1 具有抑制 TNBC 细胞的潜力（图 7P）。

本项研究对来自 168 例恶性和良性乳腺疾病患者的 224 个样本进行了全面的多组学分析，揭示了 BRDC进展的特点，例如TP53 突变相关ESR1 过表达参与了从导管增生到导管原位癌的转变。NR3C1过表达有助于 DCIS_Pure细胞避免免疫破坏。TIAM1-AR-AKR1C1轴促进 DCIS_adjIDC中的细胞侵袭和迁移。此外，AKR1C1 可作为潜在的治疗靶点，并证明了阿司匹林和地屈孕酮作为其抑制剂对肿瘤细胞的抑制作用。