文献解读|Nature（56.1）：细胞内补体因子H保护炎症环境中的神经元

多发性硬化（MS）是一种中枢神经系统（CNS）慢性炎症性疾病，持续的神经元和轴突损伤是残疾进展的重要原因。现有治疗主要调节外周免疫反应，如何增强神经元自身抵御炎症损伤的能力，仍是神经保护研究的关键问题。视网膜神经节细胞（RGC）负责将视觉信息传向大脑，其轴突构成视神经，在MS中可发生明显退变。不同RGC亚型具有不同的转录特征和损伤敏感性，为寻找神经元内源性保护机制提供了切入点。补体因子H（CFH）通常被视为分泌到细胞外的补体替代途径抑制因子，其在神经元内部是否具有独立功能尚不清楚。本研究通过人视网膜单核RNA测序（snRNA-seq），将RGC亚型在MS中的相对保留程度与基因表达联系起来，随后结合人脑组织、实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠和原代神经元实验，解析CFH对氧化应激、脂质过氧化及神经元存活的调控作用。

为寻找神经元抵御炎症损伤的内源性因素，作者首先利用神经元核标志物NeuN和RGC标志物RBPMS，从人尸检视网膜中分选RGC细胞核并开展snRNA-seq，建立覆盖对照与MS样本的转录图谱（图1A-B）。经质量控制获得105,502个RGC细胞核，统一流形近似与投影（UMAP）降维及RBPMS表达验证显示，两组均包含主要RGC类型，为比较不同亚型的易损性提供了基础（图1C-D）。进一步比较各亚型在RGC群体中的相对比例，发现MS相关损伤具有明显的亚型选择性：侏儒型RGC中的MG-ON4、MG-OFF2，以及内在光敏性RGC（ipRGC）的相对比例下降最为突出；ON型伞状RGC（PG-ON）、RGC26和RGC13则相对保留较多（图1E-I）。作者据此排列亚型的抗损伤能力，并将各样本、各亚型的伪批量基因表达与该排序关联，发现CFH表达越高，亚型的相对保留程度越高；G蛋白偶联受体149（GPR149）则呈相反关系，提示两者分别关联抗损伤和易损状态（图1J-K）。随后，单分子荧光原位杂交（smFISH）在人视网膜组织中进一步验证：MS样本中CFH阳性RGC的比例升高，而GPR149阳性RGC的比例降低，与测序筛选结果一致（图1L-M）。这些结果将不同神经元亚型的选择性退变与其分子特征相联系，并把CFH确定为后续功能验证的重点候选因子。

在视网膜筛选结果的基础上，作者将研究扩展至其他CNS区域，考察CFH是否参与更广泛的神经元保护。人尸检皮质免疫组织化学显示，对照脑组织中CFH阳性神经元较少，而原发或继发进展型MS患者的慢性活动性病灶及外观正常灰质中，CFH阳性神经元均明显增加，说明这种应答并不局限于视网膜或肉眼可识别的病灶（图2A）。在EAE小鼠中，脊髓运动神经元的CFH荧光信号在急性期和慢性期均高于健康状态，与人组织中的变化相呼应（图2B）。为确定CFH的功能作用，作者在条件性Cfh小鼠中使用神经元特异性启动子驱动的腺相关病毒（AAV）表达Cre重组酶，获得神经元特异性Cfh缺失模型，并与表达绿色荧光蛋白（GFP）的对照进行比较。诱导EAE后，Cfh缺失小鼠的临床评分更高，提示缺少神经元CFH会加重整体疾病表现（图2C）。Optodrum视动反应检测进一步显示，两组在疾病诱导前的视敏度相近，而Cfh缺失组在急性期和慢性期出现更明显的视敏度下降，将分子干预与实际视觉功能损害联系起来（图2D）。组织学检查也给出一致证据：Cfh缺失组脊髓腹角神经元数量减少，免疫后26天的脊髓后索总神经丝染色显示轴突数量下降，表明神经元胞体和轴突均受到更严重损伤（图2E-F）。人组织中的诱导表达与小鼠中的缺失表型共同支持，CFH是炎症环境下神经元的一种保护性应答，其存在有助于维持神经组织完整性和视觉功能。

为明确CFH的保护作用及其结构基础，作者构建全长CFH和多种截短、修饰形式，包括同时含有N端与C端结构域的小鼠同源二聚体最小因子H（mHDM-FH）、主要携带N端结构域的融合蛋白CR2-FH，以及删除或单独表达第20个短一致性重复结构域（SCR20）的构建体（图3A）。在EAE诱导前通过AAV实现神经元表达后，mHDM-FH降低慢性期临床评分，并保留更多脊髓腹角神经元；CR2-FH未显示相同改善，提示两者不同的C端组成与保护作用有关（图3B-C）。作者随后在原代皮质神经元中敲除Cfh，并分别给予谷氨酸、丙二醛（MDA）或谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）抑制剂RSL3刺激。三种处理下，Cfh缺失均降低细胞活力，同时增加活性氧（ROS）及脂质过氧化，说明内源性CFH参与对抗多种氧化损伤（图3D-F）。反向表达实验进一步显示，全长CFH、mHDM-FH和SCR20能够改善受刺激神经元的存活，而删除SCR20的构建体及CR2-FH不能提供同等保护，将关键功能定位到SCR20（图3G-I）。CellROX成像与定量显示，含SCR20的构建体降低谷氨酸、MDA和RSL3诱导的ROS积累（图3J-M）；脂质氧化探针BODIPY C11的成像及比值分析则显示，这些构建体同步减轻膜脂过氧化（图3N-Q）。由动物病程到细胞存活，再到氧化损伤指标，多层结果共同表明CFH的神经保护与SCR20介导的抗氧化、抗脂质过氧化作用密切相关。

作者进一步在体内检验SCR20的重要性，并区分CFH的细胞内作用与经典补体调控功能。EAE小鼠中，mHDM-FH可减轻临床症状、保留脊髓腹角神经元并降低神经元MDA信号；删除SCR20后，这些保护效应明显减弱，视网膜中被转导RGC的存活也不及完整mHDM-FH组，支持SCR20对体内神经保护的关键作用（图4A-D）。为考察保护是否需要分泌，作者删除分泌信号肽，构建保留于细胞内的mHDM-FH（ΔSP）。该构建体仍能改善谷氨酸、MDA或RSL3处理后的神经元活力，并降低ROS、脂质过氧化及MDA信号；同时删除SCR20和信号肽后则失去相同保护，说明细胞内发挥作用的CFH仍需保留SCR20（图4E-H）。随后，研究在补体成分C3缺失小鼠中表达mHDM-FH，发现其依然能够改善EAE病程、保留腹角神经元并减轻急性期和慢性期视敏度下降，表明保护作用可在缺少C3的条件下维持（图4I-K）。进一步的体内表达实验显示，仅表达不分泌的mHDM-FH（ΔSP），或单独表达SCR20，均能改善疾病表现并减少免疫后30天的神经元丢失（图4L-O）。视觉检测则显示，mHDM-FH、mHDM-FH（ΔSP）和SCR20均有助于保留疾病过程中的视敏度（图4P）。这些互相补充的干预将神经保护定位于CFH的细胞内抗氧化功能，证明SCR20既是关键功能结构域，也可作为独立的保护性模块开展后续研究。

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